1.適用範圍：本檢驗方法適用於罐頭食品，瓶裝食品，真空包裝食品，真
空調理食品，洋香腸，洋火腿，蜂蜜，嬰兒奶粉，麥粉，米粉、果汁，
混合穀類食品，醃製食品，煙燻魚製品中肉毒桿菌及其毒素之檢驗。
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2.實驗室的預防措施：
2.1.在大門懸掛生物危害標誌，管制人員進入，以及將實驗室內的人數維
持至最低需求量。
2.2.所有工作人員，均應穿著實驗衣並戴安全眼鏡。
2.3.配製胰蛋白酵素溶液時，應於生物危害抽氣櫃中稱重並戴口罩。
2.4.工作前、後應以 1％次氯酸溶液擦拭工作檯。
2.5.絕不可以用口吸取任何檢體，應該以機械式吸管輔助器操作。
2.6.實驗操作儘可能於生物危害抽氣櫃進行操作。
2.7.檢體應置於密封且具有安全杯之離心機內離心。
2.8.檢驗後工作人員應親自將所使用過之器材及廢棄物，立即送進滅菌釜
滅菌。
2.9.下班後或週末假日，不要單獨一個人在實驗室或動物室中工作。
2.10. 應有洗眼用噴水器，及腳踏或自動式洗手設備。
2.11. 嚴禁在實驗室內飲食。
2.12. 應在明顯處張貼可獲得治療用肉毒桿菌抗毒素的緊急連絡電話號碼
。
2.13. 實驗室保持整潔，設備及材料使用完後放置回適當之位置。
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3.器具及材料：
3.1.冰箱
3.2.清潔乾燥紙巾
3.3.本生燈或酒精燈
3.4.已滅菌的開罐器
3.5.已滅菌的研缽及杆臼
3.6.已滅菌的鑷子
3.7.已滅菌的有棉花栓子的吸管
3.8.吸管輔助器
3.9.已滅菌附螺旋蓋的培養試管及玻璃瓶
3.10. 厭氧箱
3.11. 厭氧包
3.12. 接種用白金耳
3.13. 恆溫培養箱， 35℃ 和 26 ℃。
3.14. 已滅菌之檢體保存箱
3.15. 菌株培養試管放置用試管架
3.16. 光學顯微鏡用載玻片，蓋玻片
3.17. 相位差或亮視野 (bright field) 顯微鏡
3.18. 滅菌培養皿
3.19. 附密封蓋離心管
3.20. 高速、低溫離心機，可達 7,500 Xg 以上
3.21. 注射筒： 1 mL 及 3 mL ，附 25 號， 5/8 吋的注射針
3.22. 小鼠：雄性，體重 16～24 g
3.23. 小鼠用籠子、飼料、飲水瓶等
3.24. 恒溫水浴，可達 100 ℃
3.25. 強韌防水無菌塑膠袋
3.26. 透析膜：36－32，於 121 ℃ 滅菌 15 分鐘
3.27. 已滅菌的濾膜， 0.2 μ m 孔徑，親水性醋酸纖維膜
3.28. 培養基
3.28.1. 肉質培養基 (Cooked Meat Medium , CMM) 454g
牛心 (Beef heart) 20g
蛋白 (Proteose peptone) 2g
葡萄糖 (Dextrose) 5g
氯化鈉 (NaCl) 1L
蒸餾水 (Distilled water)
稱取脫水肉質培養基 1.25 g 置入 20 × 150 ㎜ 的試管中，加
入冷卻的蒸餾水 10 mL (或是稱取 12.5 g 加入冷卻的蒸餾水
100 mL ) ；充分混合並使之完全溼潤後 (約需 15 分鐘) ，於
121 ℃殺菌 20 分鐘，最後 pH 值為 7.2 ± 0.2 。
3.28.2. 胰化酪蛋白－蛋白柬－葡萄糖－酵母抽取物培養液 (Trypticase
-Peptone-Glucose-Yeast Extract Broth , TPGY )
胰化酪蛋白 (Trypticase) 50g
蛋白柬 (Peptone) 5g
酵母抽取物 (Yeast extract) 20g
葡萄糖 (Glucose) 4g
硫甘醇鈉 (Sodium thioglycollate) 1g
蒸餾水 1L
使完全溶解後，分裝15 mL至 20 × 150 ㎜ 試管中，於 121℃
殺菌 10 分鐘。最後 pH 值為 7.0 ± 0.2 。於 5 ℃ 冷藏。
3.28.3. 厭氧蛋黃培養基 (Anaerobic Egg Yolk Agar, AEYA )
酵母抽取物 (Yeast extract) 5g
胰化蛋白 (Tryptone) 5g
示蛋白柬 (Pepteos peptone) 20g
氯化鈉 (NaCl) 5g
洋菜 (Agar) 20g
蒸餾水 1L
使完全溶解後，121 ℃殺菌 15 分鐘，最後 pH 值 為 7.0 ± 0
.2。待冷卻至 48～50℃ ，添加市售蛋黃液 80mL 並充分混合避
免產生氣泡。隨即傾倒 15～20mL 的培養基至每一培養皿。待凝
固後，在室溫乾燥 2～3 天，或在 35℃ 下乾燥 24 小時。使用
前確認培養基未受污染，乾燥後之培養基可冷藏貯存於一短暫時
間。
3.28.4. 胰化酪蛋白－蛋白柬－葡萄糖－酵母抽取物－胰蛋白酵素培養液
(Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast Extract Broth with
Trypsin, TPGYT)
胰蛋白酵素溶液 (Trypsin solution) 之配製：
胰蛋白酵素 (1:250 ) 1.5g
蒸餾水 100mL
將胰蛋白酵素加入蒸餾水中使完成懸著，靜置並使顆粒穩定，以
0.45 μm 的濾膜過濾上清液。使用前以蒸氣或沸水加熱 10 分
鐘去除液體中之溶氧。
加入 1 mL 胰蛋白酵素溶液於 15mL 的 TPGY ，或加入 6.7 mL
胰蛋白酵素溶液於 100 mL 的 TPGY 。
3.29. 試劑：
3.29.1. 碘酒 (Alcoholic solution of iodine)
碘 10g
碘化鉀 10g
70 ％酒精 500mL
3.29.2. 明膠－磷酸緩衝液 (Gel-phosphate buffer), Ph6.2
明膠 (Gelatin ) 2g
磷酸氫二鈉 (Na2HPO4 ) 4g
蒸餾水 1L
微加熱至溶解，以 121 ℃ 滅菌 20 分鐘，最終 pH 值為 6.2。
3.29.3. 無水酒精 (Absolute alcohol)
3.29.4. 格蘭氏染色液 (Gram stain solution ) ：格蘭氏染色液組包括
哈克氏結晶紫液 (Hucker's crystal violet ) 、格蘭氏碘液、
格蘭氏脫色劑，及格蘭氏複染液 (Safranin) 。
3.29.5. 0.85 ％滅菌生理食鹽水
3.29.6. 1N 氫氧化鈉溶液
3.29.7. 1N 鹽酸溶液
3.29.8. 50 ％滅菌甘油水：取甘油 50 g 加蒸餾水至 100 mL ，於 121
℃ 滅菌 15 分鐘。
3.29.9. Ａ－Ｆ型單價肉毒桿菌抗毒素與Ａ－Ｆ型多價肉毒桿菌抗毒素 (
Centers for Disease Control and Prevention , Atlanta,
U.S.A.) ：冷凍乾燥的抗毒素以滅菌 50 ％甘油水依標示復水，
供作抗毒素原液備用。以生理食鹽水對抗毒素原液行 5 倍稀釋
，供注射小鼠用。
3.29.10. 10 ％胰蛋白酵素溶液：取胰蛋白酵素 (1:250 ) 1.0g 至乾淨
培養試管中，加蒸餾水 10mL 振搖，微熱至溶解。
3.29.11. 1 ％ 次氯酸鈉 (sodium hypochlorite ) 溶液
3.29.12. 50 ％蛋黃液
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4.檢體之處理
將檢體冷藏於冰箱中，直至檢驗時方取出。除非有快速膨罐及爆裂之慮
，未開封的罐頭食品不需存放于冰箱中。試驗前，記錄產品名稱，製造
廠商名稱或是家庭製作，檢品來源，容器型式及大小，標示，製造批次
，批號或產品代碼，以及容器外觀等資料。清洗容器之外觀，並標示實
驗室代碼。
4.1.固體及液體食品
在無菌環境中將固體食品或僅含少量液體的食品，置入滅菌的研缽中
，加入等量的滅菌明膠－磷酸緩衝溶液，並用已滅菌的研杵研磨後 (
或用已滅菌的鑷子夾取小塊檢體) ，直接接種於增菌 CMM 中；液體
食品則用已滅菌的吸管，直接接種於增菌 CMM 中。接種完後，將剩
餘檢體以無菌方式操作保存在已滅菌的檢體保存罐中，並冷藏保存檢
體，以備爾後需用。
4.2.罐頭食品
檢查檢體之外觀及氣味，記錄任何產品分解之事證，及所見之狀況。
在任何情況下，均不可以口嚐試檢體。
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5.肉毒桿菌檢測：
5.1.增菌：
5.1.1.一般食品
接種前將增菌用培養基以蒸氣或沸水加熱 10～15 分鐘以去除溶氧
，快速冷卻並避免要振盪。取二支裝有 CMM 的試管，分別接種入
1～2 g 或 1～2mL 的檢體，置於 35 ℃培養。依前述方法同時接
種二支 TPGY 的試管，置於 26 ℃培養。當懷疑檢體中有非蛋白水
解性Ｂ型，Ｅ型、或Ｆ型產毒肉毒桿菌時，接種檢體至 TPGYT 中
增菌。緩緩的將檢體沿管壁接種至試管底部，接種後七日，檢查增
菌培養基。檢查項目應包括：混獨度，氣體產生，及粒狀培養基的
消化情形，並注意氣味。培養 7 日後，若沒有明顯的細菌增長現
象，則再繼續培養 10 日。
5.1.2.煙燻魚製品
將 1 尾或數尾 (視檢體體積大小而定) 真空包裝或是散裝的煙燻
魚製品，置入強韌且防水的無菌塑膠袋中。添加已滅菌冷卻的 TP-
GY 至淹蓋過檢體，擠壓塑膠袋以去除多餘的空氣，以膠袋密封容
器或其他類似器具封閉塑膠袋。於 26～28 ℃下培養 7 日，培養
期間注意因產生氣體所引起的塑膠袋膨脹及破裂。
5.1.3.蜂蜜
將檢體置於 45 ℃水浴中一小時後，反覆上下倒置約 50 次，取25
g 檢體置於已滅菌的三角瓶中，加入 20mL 無菌水，使蜂蜜溶解後
，倒入已滅菌之透析膜 ( 44 mm× 45 cm，事先將一端以線封綁，
以 121℃，滅菌 15 分鐘) 。以無菌水洗滌三角瓶瓶底之殘餘蜂蜜
，倒入透析膜中，以線將另一端開口綁緊後置於蒸餾水中並將透析
膜淹蓋， 4℃下透析 24 小時，分別在第 2、4、19 小時換水，透
析後之體積約 140 mL 。剪開透析膜時，先以 1％次氯酸鈉溶液擦
拭透析膜前端。例入已預先放入 5g CMM (加少量的水濕潤，以 1
21 ℃ 滅菌 15 分鐘) 具瓶蓋之 300 mL 玻璃瓶中；以無菌水加至
150 mL 之刻度，透析膜以 60mL 雙倍濃度之 TPGY 洗滌後倒入瓶
內，重覆二次，最後以 TPGY 洗滌後倒入瓶內，重覆二次，最後以
TPGY 將瓶內體積加至 300 mL ，再將此瓶於 80 ℃的水浴中加熱
25 分鐘後，置於 35 ℃無氧環境，培養 7 天。
緩緩的將檢體沿管壁接種至試管底部，接種後七日，檢查增菌培養
基之混獨度，氣體產生，及粒狀培養基的消化情形，並注意氣味。
培養 7 日後，若沒有明顯的細菌增長現象，則再繼續培養 10 日
。
5.2.分離菌株：
5.2.1.前處理
添加與培養液等量經過濾滅菌的無水酒精，至盛有 1 或 2 mL 5.
1.已接種增菌培養液之已滅菌附螺旋蓋的試管中。充分混合，在室
溫下培養 1 小時。若欲直接自檢體中分離肉毒桿菌，則取 1 或
2mL 保留之檢體，加入等量經過濾滅菌的無水酒精於附螺旋蓋的試
管中，充分混合，在室溫下放置 1 小時。或以 80 ℃加熱 10～1
5 分鐘 1 或 2 mL 已接種增菌培養液或是檢體，以破壞營養細胞
(註 1) 。
註 1：絕對不可以加熱方式處理非蛋白水解型肉毒桿菌。
5.2.2.劃線培養
以接種環取 1 或 2 環經酒精或加熱處理的增菌培養液，劃線接
種於 AEYA 上 (註 2) 。必要時，適當稀釋此培養液以便獲得良好
分離的單一菌落。在厭氧環境， 35 ℃下培養 48 小時 (註 3) 。
註 2：使用表面乾燥之 AEYA 。
註 3：採用厭氧缸或是厭氧性氣體產生系統，以維持一厭氧環境，
然而也可使用其他相似的系統以維持厭氧環境。
5.3.典型菌落的選取：
5.3.1.肉毒桿菌之典型菌落形態凸起或扁平、平滑或粗糙菌落、亦有菌落
呈現擴散而周緣輪廓不規則狀。在 AEYA 上，以斜角度檢視培養基
時，菌落常呈現真珠光澤。這一真珠光澤區域常常跨越過菌落週緣
之不規則狀輪廓，而呈現向外擴散之趨勢。除了真珠光澤區域外，
Ｃ型、Ｄ型、及Ｅ型肉毒桿菌之菌落，其外常圍繞著一約 2～4 ㎜
寬的黃色沈澱環。Ａ型及Ｂ型肉毒桿菌，通常菌落周圍的沈澱環較
小 (註 4)。
註 4：為數甚多的梭狀桿菌屬細菌 (Clostridium spp.) 之菌落形
態與肉毒桿菌相似，但不會產生肉毒桿菌毒素，故在選取肉
毒桿菌菌落時，須靠經驗來克服。
5.3.2.用已滅菌的接種環，選取 10 個各別生長良好的典型菌落接種至已
滅菌的 CMM ，於 35 ℃厭氧培養七日。接種Ｅ型肉毒桿菌至已滅
菌的 TPGY ，於 26 ℃厭氧培養七日。七日後檢測毒素產生與否，
其步驟依下節肉毒桿菌毒素之檢測。
5.3.3.將產生毒素的培養液，以二重複再次劃線於 AEYA 。其中一個培養
基置於厭氧下 35 ℃培養，另一個置於耗氧下 35 ℃培養。典型的
肉毒桿菌菌落，僅生長在厭氧環境下 (註 5) 。將分離純化的肉毒
桿菌，以芽胞狀態與保存珠一起貯存於冰箱中，或是凍結乾燥保存
。
註 5：肉毒桿菌在混合菌叢中相對的分離比例甚低，可經由系列性
連續的額外增菌培養步驟，以提高菌落之分離率。
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6.毒素的檢測與型別鑑定：
6.1.檢體的處理：
將檢體分為三部份，一部份用於檢測肉毒桿菌的活菌，一部份用於毒
性試驗，其餘部份則保存於冰箱中。
6.1.1.液體食品
取前述 5.1.TPGY 增菌培養液 20mL ，以 7,500 Xg 低溫離心 20
分鐘，測定培養液之 pH 值，若是超過 pH 6.5 ，則以 1N 鹽酸溶
液調整至 pH 6.0～6.2。冷藏保存隔夜。
6.1.2.固體食品
取經預冷 (prechilled) 處理的研缽及研杵，加入固體檢體及等量
的 pH 6.2 滅菌明膠－磷酸緩衝液，當檢體浸軟後研磨，於低溫離
心檢體，使用上清液進行毒性試驗。
6.1.3.可疑容器檢體
取已滅菌明膠－磷酸緩衝溶液數毫升，清洗盛裝檢體之容器；儘可
能減少明膠－磷酸緩衝溶液的用量，防止毒素被稀釋至檢測極限之
下的情形。
6.2.毒性確認：
6.2.1.胰蛋白酵素處理：
為易於檢測非蛋白水解性毒素，可取一部份檢液、液體食品、或 T
PGY 培養液，在檢測毒素前先以胰蛋白酵素處理 (註 6) 。將檢體
離心後，以 1N 的氫氧化鈉溶液或 1N 的鹽酸溶液，調整離心檢體
上清液的 pH 值至 6.2，作為檢液。取 1.8 mL 的各檢液分別注入
試管中，添加 0.2 mL 的胰蛋白酵素溶液，在 35～37℃ 放置 1
小時，時時搖動之，以供檢測檢體之毒性。
註 6： TPGY 培養液中含有胰蛋白酵素，不必再以胰蛋白酵素處理
，若再經胰蛋白酵素處理可能使存於其中的任何完全活化毒
素被分解迨盡。
6.2.2.毒性試驗：
以明膠磷酸緩衝液將檢液稀釋成 5，10，及 100 倍的稀釋檢液。
所有檢液包括原液、及各稀釋檢液，對小鼠腹腔注射 0.5 mL ，均
行二重複試驗。取 1.5 mL 未經胰蛋白酵素處理組檢液，於 100
℃加熱 10 分鐘；待冷卻後，每一檢液取 0.5 mL 對小鼠腹腔注射
，行二重複試驗 (註 7) 。 48 小時內定時觀察試驗小鼠有無肉毒
桿菌毒素中毒症狀及死亡，並做作成記錄。典型的肉毒桿菌毒素中
毒症狀，在投予檢液 24 小時內，引起小鼠皮毛豎立、繼至呼吸困
難、四肢軟弱，終至呼吸麻痺，吸吸衰竭死亡 (註 8) 。經過 48
小時觀察，若所有的小鼠均死亡，僅有接受熱處理檢液的小鼠存活
，則須使用更高倍數的稀釋檢液，重複此一毒性試驗。此毒性試驗
中必須要有殺死小鼠的稀釋倍數及不會殺死小鼠的稀釋倍數，以建
立一試驗終點或是最小致死量，憑以預估毒素含量。能殺死所有接
種小鼠的最高稀釋倍數謂之最小致死量，從這些數據，可以計算出
每 mL 檢液中含肉毒桿菌毒素的最小致死量數值。
註 7：熱會破壞肉毒桿菌毒素，因此檢液經 100 ℃ 加熱 10 分鐘
後，應不會引發小鼠死亡。
註 8：沒有肉毒桿菌毒素中毒症狀的小鼠死亡，表示檢液中不含有
肉毒桿菌毒素，小鼠之死亡可能肇因於其它化學物質或外力
(trauma) 。
6.2.3.毒素型別鑑定：
將Ａ、Ｂ、Ｅ及Ｆ型抗毒素原液，以滅菌生理食鹽水稀釋至每毫升
含有 2 個國際單位 (註 9) 。使用最高稀釋倍數所獲得的最小致
死量 (包括未處理組及胰蛋白酵素處理組) 的檢液，進行毒性檢液
的製備，其中至少需包括最小致死量的 10 ，100 及 1,000 等稀
釋倍數。未處理的毒性檢液，依照 6.2.2. 的方法進行製備 (註 1
0 ) 。
腹腔注射 0.5 mL 的各型單價肉毒桿菌抗毒素 (每毫升含有 2 個
國際單位) ，經 30 分鐘至 1 小時後，再腹腔注射 0.5 mL 的檢
液，每一稀釋檢液均行二重複試驗。每一稀釋之毒性檢品，亦注射
至二隻未經任何抗毒素保護的小鼠，以作為對照組。使用Ａ、Ｂ、
Ｅ及Ｆ四型單價抗毒素，每一抗毒素計使用 6 隻小鼠，四種抗毒
素，共 24 隻小鼠，外加三種稀釋對照組檢液，共 6 隻小鼠，合
計使用 30 隻小鼠。觀察小鼠 48 小時，並記錄肉毒桿菌毒素中毒
症狀及死亡。若試驗結果顯示毒素未被中和，則使用單價抗毒素測
定Ｃ型和Ｄ型毒素，與多價抗毒素重新測定Ａ型至Ｆ型毒素。
註 9：絕不可以使用甘油水溶液稀釋抗毒素原液。
註 10 ：經胰蛋白酵素處理的檢液其致死性最高，由於胰蛋白酵素
的持續作用，會破壞肉毒桿菌毒素，因此在毒素型別鑑定
時，檢液必須採用胰蛋白酵素新鮮處理者。
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7.肉毒桿菌毒素分析須知：
7.1.試驗初起 24 小時，是小鼠的症狀和死亡的關鍵時刻， 98～99％ 的
試驗動物於 24 小時內死亡。典型的肉毒桿菌中毒症狀和死亡，可能
發生在投予含肉毒桿菌毒素之檢液後 4 到 6 小時內。
7.2.若死亡發生在 24 小時之後，除非有非常明確的典型肉毒桿菌中毒症
狀，否則僅屬疑似個案。
7.3.若注射 1:2 或是 1:5 倍之稀釋檢液的小鼠死亡，但不見任何注射
更高稀釋倍數檢液的小鼠死亡，則僅屬疑似個案，小鼠死亡可能是由
於不明原因所致。
7.4.可用不易脫落之染料塗佈在小鼠尾部，以供識別投予不同稀釋倍釋檢
液之用。
7.5.注射肉毒桿菌毒素的小鼠，在出現症狀之前可能變得較為過度活動 (
hyperactive ) 。
7.6.注射檢液後立即供應小鼠食物及飲水並不會影響試驗之正確性。
7.7.復水後的抗毒素可冷藏維持 6 個月的效期，冷凍保存則可維持更長
的效期。
7.8. TPGY 具有相當的穩定性，可冷藏保存 2～3 週。
7.9.使用 CMM 培養基應旋緊試管蓋，因為肉毒桿菌毒素可能吸著於培養
基之肉粒上。
7.10. 胰蛋白酵素溶液無需濾過，將 1g 胰蛋白酵素溶解在 10mL 蒸餾水
中，可冷藏存放 1 週。
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8.試驗資料之解讀：
8.1.若消費者未能徹底加熱食品，則存於食品中的肉毒桿菌毒素能夠引致
肉毒桿菌毒素中毒。
8.2.食品中存有活的肉毒桿菌，但是沒有檢測出毒素，不能證明此一食品
是引發肉毒桿菌中毒之原因食品。
8.3.食品中存有肉毒桿菌毒素，係引起肉毒桿菌毒素中毒的必備要件。
8.4.肉毒桿菌不能在活體內增生及產生肉毒桿菌毒素，但在嬰兒體內則可
以。
8.5.在低酸性罐頭食品中存有肉毒桿菌毒素或菌體，表示此罐頭滅菌不完
全，或是加工後經由孔隙污染。
8.6.由於肉毒桿菌生長過程中會產生氣體，因此膨罐較平罐更容易有肉毒
桿菌毒素的存在。
8.7.平罐而有肉毒桿菌毒素者，表示罐頭密封不全。
8.8.由於蛋白分解性胞子具有較高的耐熱性，因此常見於罐頭內的肉毒桿
菌毒素是Ａ型，或蛋白水解性Ｂ型。
8.9.非蛋白分解性的Ｂ、Ｅ及Ｆ型胞子，一般耐熱性較低，故經熱處理即
無法存活。
8.10. 注射單價肉毒桿菌抗毒素之小鼠，再注射檢液可免於中毒和死亡，
即可確認檢體中含有肉毒桿菌毒素，及其毒素型別。
8.11. 小鼠若無法受到一種單價肉毒桿菌抗毒素的保護，仍然有死亡發生
時，可能是由於檢體中的肉毒桿菌毒素含量太高，或是檢體中可能
存有一種以上的肉毒桿菌毒素，亦有可能由其他不明原因所引起的
。
此時必須對含肉毒性之檢液進行高倍率稀釋，且以多價肉毒桿菌抗
毒素取代單價肉毒桿菌抗毒素。某些耐熱之毒性物質，可能引起加
熱組及未加熱組試驗小鼠死亡。這些耐熱之毒性物質，可能遮掩肉
毒桿菌毒素的毒性。
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