1.適用範圍：本檢驗方法適用於禽畜等產品中殘留健牠黴素之檢驗。

2.檢驗方法：高效液相層析法（hign performance liquid chromatogra-
  phy, HPLC）
  2.1 裝置：
    2.1.1 高效液相層析儀
      2.1.1.1 溶媒輸送系統：具移動相溶液及後置反應溶液之輸送系統
              。
      2.1.1.2 檢出器：螢光檢出器。
      2.1.1.3 後置反應裝置（Post-column reactor）。
      2.1.1.3.1 恆溫槽：可加熱並恆溫於45℃。
      2.1.1.3.2 後置反應圈：內徑 0.5mm×3.6m之不鏽鋼管。
      2.1.1.4 層析管：RP-18 ，5μm，內徑 4.6mm×25cm。
      2.1.1.5 層析管恆溫箱：可加熱並恆溫於45℃。
    2.1.2 冷凍離心機（Refrigerated contrifuge）：轉速可至 7,000g
          ，溫度能維持45℃以下者。
    2.1.3 均質機（Virtis blender）。
    2.1.4 酸鹼值測定儀（pH meter）。
    2.1.5 超音波震盪器（Ultrasonic bath）。
  2.2 試藥：
      三氯乙酸（ Trichloroacetic acid, TCA）、二水合DATA－二納鹽
      （ Disodium ethylenediamine tertra-acetic acid dihydrate）
      、樟腦磺酸鈉鹽（sodiumdl-camphor-10-sulphonate）、鄰苯二甲
      醛（o-phthalaldehyde）、乙硫醇（ 2-mercaptoethanol）、十二
      醚（Brij(R)－35）、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化納（ Sodium
      azide）、硫酸鈉，無水磷酸氫二鉀、離子交換樹脂（CM-Sephadex
      C-25）採化學試藥級；甲醇、乙醇採液相層析級；健牠黴素對照標
      準品。
  2.3 器具及材料：
    2.3.1 離心管（Centrifuge tube）：鐵夫龍材質，容量為40mL。
    2.3.2 玻璃過濾器（Glass filter holder）。
    2.3.3 定容瓶（Volumetric flasks）：50mL、100mL、250mL及1000m
          L 。
    2.3.4 濾膜（Filter）：孔徑 0.2μm ，nylon 材質。
    2.3.5 均質杯：50mL。
    2.3.6 離子交換樹脂管柱：
          取CM-\sephadex C-25樹脂5g，以2.4.4節溶液50mL浸泡過液後
          取 1.5mL充填入內徑0.8×4cm。
          下端鋪有一層聚乙烯墊片之塑膠管柱中，管柱上端鋪上玻璃棉
          備用。
  2.4 試劑之調制：
    2.4.1 1mM edta溶液：
          稱取二水合EDTA－二鈉鹽 372mg溶於去離子水 700mL，並定容
          至1000mL。
    2.4.2 5 ％三氯乙酸溶液：
          稱取三氯乙酸 50g溶於去離子水中，並定容至1000mL。
    2.4.3 EDAT/TCA溶液：
          取EDTA－二鈉鹽 372mg溶於 5％三氯乙酸溶液1000mL。
    2.4.4 EDTa/0.2M 硫酸鈉／疊氮化鈉溶液。
          稱取硫酸鈉 28.4g及疊氮化鈉 200mg溶於 1mM EDTA 溶液1000
          mL。
    2.4.5 0.1M鍰衝溶液（pH 7.0）：
          稱取硫酸鈉 14.2g及無水磷酸氫二鉀 17.4g以去離子水 700mL
          溶解後，調其pH至 7.0，最後以去離子水定容至1000mL。
    2.4.6 0.5M樟腦硫酸鈉鹽溶液：
          稱取樟腦磺鈉鹽 12.7g酸溶於去離子水 100mL。
    2.4.7 移動相溶液：
          稱取樟腦磺酸鈉鹽 12.7g，以 1mM EDTA 溶液1000mL溶解，加
          入除氣去離子水約 500ml，以鹽酸調其pH至 2.2，除氣去離子
          水定容至1000mL。最後再與甲醇以45：55（v/v） 比例混合，
          臨用前以0.2μm濾膜過濾。
    2.4.8 後置反後溶液：
          取硼酸5.3g及30％氫氧化鈉溶液 7.5置入 250ml溶量瓶，加入
          除氣去離子水約 200mL。另取鄰苯二甲醛0.2g溶於95％乙醇溶
          液10mL，到入容量瓶中，再加入乙硫醇 0.5ml及30％十二醚溶
          液 1mL，最後以除氣去離子水定容至 250mL。此溶液需於24小
          時內使用。
  2.5 標準溶液之配製：
      取健牠黴素對照標準品 100mg，精確稱定，以去離子水溶解並定容
      至 100mL作為標準原液。使用時，以 1mM EDTA 溶液稀釋，配製成
      濃度為0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8及 1.0μg/mL之標準溶液。
  2.6 檢液之調製：
    2.6.1 萃取：
          取已解凍細切之檢體5g，精確稱定，置於50mL均質杯中。加入
          2.4.3 節溶液20mL，以均質機均質10分鐘。將均質物移入離心
          管中，於 4℃以700g離心15分鐘，將上澄液移至50mL容量瓶中
          ，以30％氫氧化鈉溶液調整其pH至 7.0± 0.1，最後以0.1M鍰
          衝溶液定容至50mL。
    2.6.2 淨化：
          將 2.3.6節製備好之離子交換樹脂管柱以 2.4.4節溶液 1mL潤
          洗 2次，棄洗液。取 2.6.1節萃取液10mL，以每次 1mL全部注
          於管柱中，再依序以 2.4.4節溶液 1mL、去離子水 1mL及0.05
          氫氧化鈉溶液250μL洗 2次。棄洗液。最後以 0.05M氫氧化鈉
          溶液 1mL沖提，收集沖液加入1M鹽酸及0.5M樟腦磺酸鈉。
          鹽溶液各100μL供作檢液。
  2.7 鑑別試驗及含量測定：
      精確量取檢液及標準溶液各100μL，分別注入高效液相層析儀中，
      參照高效液相層析測定條件，就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時
      間比較鑑別之，並依下列公式求出檢體中健牠黴素之含量。
                                C × V
      檢體中健牠黴素含量（ppm）＝───
                                  M
      C ：由標準曲線求得檢液之健牠黴素濃度（μg/mL）。
      V ：檢體淨化後之體積（mL）。
      M ：取樣分析檢體之重量（g）。
      高效液相層析測定條件：
      螢光檢出器：激發波長 340nm，發紙波長 440nm。
      層析管柱：RP-18 ，5μm，內徑 4.6mm×25cm。
      層析管柱溫度：45℃。
      移動相溶液：依2.4.7 節所調製之溶液。
      移動相流速：1.2mL/min 。
      後置反應溶液：依 2.4.8節所調製之溶液。
      後置反應溶液流速：0.5mL/min 。
      後置反應溫度：45℃。
      備註：1.本檢驗方法之檢出限量於肌肉及脂肪為 0.05ppm，肝臟及
              腎臟為0.1ppm。
            2.不同食品基層是否影響檢驗結果，應自行檢討。
參考文獻：
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