1.適用範圍：本檢驗方法適用於食品中兔肉、兔心、兔肝等組織器官、兔
血或其他製品之定性檢驗。
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2.檢驗方法：聚合鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）方法及
即時聚合鏈反應（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR
）方法。
2.1.工作環境：工作平臺需寬敞、潔淨、光線良好。檢體前處理、檢體
DNA 抽取、 PCR試劑配製及 PCR等實驗過程皆需有區隔空間，避免
交叉污染。 PCR試劑之配製應於無菌操作臺內進行。
2.2.裝置（註 1）
註 1：本方法所使用或提及之產品品牌不代表為同類產品中最好者
；反之，未使用或提及之產品品牌亦不代表為同類產品中較
差者。
2.2.1.分光光度計：具波長260nm、280nm。
2.2.2.旋渦混合器（Vortex mixer）。
2.2.3.真空乾燥裝置：供 DNA乾燥用。
2.2.4.真空冷凍乾燥裝置：溫度可達 -40℃以下，真空度可達 133m
Bar 以下，供檢體乾燥用。
2.2.5.加熱振盪器：具55℃溫控及振盪功能。
2.2.6.微量冷凍離心機：可達20,000×g ，並具 4℃溫控功能。
2.2.7.離心機：供各式微量離心管離心用。
2.2.8.聚合鏈反應器：ABI PRISM 9700 Sequence Detector，或同
級品。
2.2.9.即時聚合鏈反應器（註 2）：ABI PRISM 7700 Sequence D-
etector 或 Roche LightCycler，或同級品。
註 2：確認試驗用。
2.2.10. 電泳槽：供 DNA電泳用。
2.2.11. 振盪型粉碎機：Retsch MM200，或同級品。
2.2.12. 照相裝置：供拍攝電泳膠片用。
2.2.13. 紫外燈箱：具波長 312nm、365 nm紫外燈。
2.2.14. 冷凍設備：具冷藏及凍結功能。
2.2.15. 高壓滅菌釜。
2.2.16. pH 測定儀。
2.2.17 .水浴裝置：溫差 ±1℃以內者。
2.2.18. 天平：最大秤重量為2,000g，靈敏度為0.1g；最大秤重量為
100g，靈敏度為 1mg。
2.2.19. 無菌操作臺。
2.3.試藥
2.3.1.DNA 抽取用： RNase、乙醇（96-100％）均採分子生物分析級
試藥，DNeasy ０R Tissue 套組。
2.3.2.PCR 用
2.3.2.1.鑑別試驗用引子（註 3）
註 3：合成之引子，拆封後，以無菌純水稀釋成適當濃度
，分裝後置於 -20℃貯存備用。
2.3.2.1.1.哺乳類及家禽類（標的基因： myostatin，供作內部
對照基因）
引子 F：MYF, 5'-TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3'
引子 R：MYR, 5'-ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3'
PCR 增幅產物大小 97 bp
2.3.2.1.2.兔（標的基因：12S rRNA）
引子 F：RAF, 5'-GGCCTTTTTATTGTTTTGTAGCAAC-3'
引子 R：RAR, 5'-CAAGGCATCTGAGCTACTGATTA-3'
PCR 增幅產物大小130bp
2.3.2.2.確認試驗用引子及探針（註 4）
註 4：合成之探針，拆封後，以無菌純水稀釋成適當濃度
，分裝後置於 -20℃貯存備用，探針需避光保存。
探針5'端採用6-carboxy-fluorescein（FAM）標記
，3'端採用6-carboxytetramethyl-rhodamine（TA
MRA） 標記。
2.3.2.2.1.哺乳類及家禽類（標的基因：myostatin ，供作內部
對照基因）
引子 F：MYF, 5'-TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3'
引子 R：MYR, 5'-ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3'
探針 P：MYP, 5'-（FAM）-CCCATGAAAGACGGTACAAGGT
ATACTG-（TAMRA）-3'
PCR 增幅產物大小 97 bp
2.3.2.2.2.兔（標的基因：12S rRNA）
引子 F：RAF, 5'-GGCCTTTTTATTGTTTTGTAGCAAC-3'
引子 R：RAR, 5'-CAAGGCATCTGAGCTACTGATTA-3'
探針 P：RAP, 5'-（FAM）-CACATGCAAGACTCCTCACGCC
AGTG-（TAMRA）-3'
PCR 增幅產物大小 130bp
2.3.2.3.去氧核糖核三磷酸（deoxyribonucleoside triphospha
te, d-NTP）
含去氧腺三磷酸（deoxyadenosine triphosphate, dAT
P ），去氧胞三磷酸（deoxycytidine triphosphate,
dCTP），去氧鳥糞嘌呤三磷酸（deoxyguanosine triph
osphate, dGTP）及去氧胸三磷酸（deoxythymidine tr
iphosphate, dTTP）各 2.5mM之溶液。
2.3.2.4.聚合
Taq DNA polymerase（2 U/μL）。
2.3.2.5.TaqMan Universal PCR Master Mix （確認試驗用，適用
於 ABIPRISM 7700）
內含 PCR所需去氧核糖核三磷酸、聚合等試劑，使用
者僅需自行添加引子、探針及待測檢體 DNA即可。
2.3.2.6.LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Pro
bes （確認試驗用，適用於 Roche LightCycler）
內含 PCR所需去氧核糖核三磷酸、聚合等試劑，使用
者僅需自行添加引子、探針及待測檢體 DNA即可。
2.3.3.電泳用：溴化乙錠（ethidium bromide）、瓊膠（ agarose）
、溴酚藍（bromophenol blue）、二甲苯藍（ xylene cyanol
FF）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic aci
d disodium salt, Na2-EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris （
hydroxymethyl） aminomethane（Tris））、甘油、硼酸，均
採分子生物分析級試藥。 DNA分子量標記物質（DNA molecula
r weight marker）：100-bp DNA Ladder Marker。
2.3.4.對照用物質：兔肉、兔血及其組織器官等皆可，或使用行政院
衛生署藥物食品檢驗局提供編號 pIDM2之參考質體作為對照用
物質。
2.4.器具及材料（註 5）
註 5：使用之塑膠或玻璃器皿均為無 DNAse污染。
2.4.1.吸管（Pipette） ：10μL、20μL、100μL、200μL及1000μ
L 。
2.4.2.電泳膠片製作盤。
2.4.3.吸管尖頭（Pipette tips）：10μL、20μL、200μL及1000μ
L 。
2.4.4.離心管：200μL、600μL、1.5mL 及 2mL。
2.4.5.PCR 反應管：200μL及500μL。
2.4.6.PCR 玻璃毛細管（註 6）：Roche LightCycler 專用。
註 6：儀器使用 Roche LightCycler時，才需使用。
2.4.7.玻璃或塑膠瓶：50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL 及2000
mL。
2.4.8.塑膠離心管：50mL。
2.4.9.過濾膜：孔徑為0.45μm，材質為 nitro-cellulose。
2.5.試劑之配製
2.5.1.5 倍 TBE（Tris-borate-EDTA）緩衝溶液
稱取三羥甲基氨基甲烷 54g、硼酸 27.5g及0.5M pH 8.0 EDTA
溶液20mL，加水溶解後定容至1000mL，供作 5倍 TBE緩衝溶液
。臨用前以水稀釋為 0.5倍。
2.5.2.2 ％膠片
稱取瓊膠2g，加入 0.5倍 TBE緩衝溶液 100mL，加熱攪拌至瓊
膠完全溶解，適當冷卻後，倒入電泳膠片製作盤，並置入適當
之尺梳，待膠片凝固後，即可使用。
2.5.3.6 倍載入膠片緩衝溶液（6 ×gel loading buffer）
稱取溴酚藍 25g、二甲苯藍 0.25g及量取甘油30mL，加入無菌
純水使成 100mL，並置於 4℃冰箱貯存備用。
2.5.4.膠片染液
稱取溴化乙錠0.1g，加水10mL溶解，供作原液（含溴化乙錠10
mg/mL ），使用前需以水稀釋成含溴化乙錠 1μg/mL。溴化乙
錠為致癌物質，配製時應注意安全。
2.5.5.PCR 溶液（註 7）
註 7：PCR 溶液應置於冰浴中配製。
2.5.5.1.鑑別試驗用
10倍 PCR緩衝溶液（含15mM MgCl2）…………… 2.5 μL
Taq DNA polymerase（2 U/μL）……………… 1.0 μL
2.5 mM dNTP ……………………………………… 4.0 μL
10 μM引子 F……………………………………… 1.0 μL
10 μM引子 R……………………………………… 1.0 μL
模版 DNA溶液（總量100 ng）…………………… 5.0 μL
無菌純水……………………………………………10.5 μL
總體積 ...........................................
2.5.5.2.ABI PRISM 7700 Sequence Detector確認試驗用
5 μM 引子 F………………………………………1.25 μL
5 μM 引子 R………………………………………1.25 μL
3.3 μM 探針 P…………………………………… 1.7 μL
TaqMan Universal PCR Master Mix ……………12.5 μL
模版 DNA 溶液（總量100 ng）………………… 5.0 μL
無菌純水…………………………………………… 3.3 μL
總體積………………………………………………25.0 μL
2.5.5.3.Roche LightCycler 確認試驗用
5 μM 引子 F……………………………………… 1.5 μL
5 μM 引子 R……………………………………… 1.5 μL
3.3 μM 探針 P…………………………………… 1.5 μL
LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization
Probes……………………………………………… 2.0 μL
25 mM MgCl2 溶液………………………………… 2.4 μL
模版 DNA溶液（總量100 ng）…………………… 5.0 μL
無菌純水…………………………………………… 6.1 μL
總體積………………………………………………20.0 μL
2.6.檢體 DNA 之製備
2.6.1.檢體之處理
檢體為乾燥肉乾或粉（碎）狀者，可直接以粉碎機研磨成細粉
。檢體為溼狀肉塊或肉加工品，經冷凍乾燥處理後，再以粉碎
機研磨成細粉備用。檢體需貯存於乾燥及冷藏或冷凍環境中。
2.6.2.DNA 之抽取
採用 DNeasy ０R Tissue套組及內附試劑、材料（ATL 試劑、
proteinase K試劑、AL試劑、離心管柱（DNeasy spin column
）、收集管、 AW1、 AW2與AE試劑），亦可採用其他市售套組
。
2.6.2.1.稱取檢體約25mg（註 8），置入 2mL離心管。
註 8：抽取脾臟等含細胞數量眾多的組織 DNA，稱取量不
可超過10mg。抽取肝臟或腎臟等含豐富 RNA的組織
DNA ，於步驟2.6.2.4.之後加入 RNase（100mg/mL
）4μL，混合均勻後於室溫下靜置 2分鐘。
2.6.2.2.加入 ATL試劑180μL以及 proteinase K 20 μL，以旋渦
混合器混合均勻。
2.6.2.3.於55℃振盪反應直到檢體溶解。
2.6.2.4.加入AL試劑200μL，以旋渦混合器混合均勻。
2.6.2.5.水浴70℃，10分鐘。
2.6.2.6.加入乙醇（96-100％）200μL，以旋渦混合器混合均勻。
2.6.2.7.取混合液注入離心管柱，以 6,000 ×g（8,000rpm）離心
1 分鐘，並將收集管及濾液丟棄。
2.6.2.8.將離心管柱套入新的收集管，注入 AW1試劑500μL到離心
管柱，以6,000×g（8,000rpm）離心 1分鐘後，將收集管
及濾液丟棄。
2.6.2.9.將離心管柱套入新的收集管，注入 AW2試劑500μL到離心
管柱，以20,000×g（14,000rpm）離心 3分鐘後，將收集
管及濾液丟棄。
2.6.2.10. 將離心管柱套入新的 1.5mL離心管。
2.6.2.11. 加入AE試劑100μL至離心管柱，於室溫下靜置 1分鐘後
，再以6,000×g（8,000rpm）離心 1分鐘，再重複此溶
出步驟一次。
2.6.2.12. 將溶出液（約200μL）收集至已滅菌之 1.5mL離心管，
為萃取 DNA原液。
2.6.2.13. 依2.6.3.2.節測量 DNA濃度並記錄後，置於-20 ℃冷凍
保存。
2.6.3.DNA 濃度測定及純度判斷
2.6.3.1.檢體 DNA溶液於使用前自冷凍庫中取出，於室溫下進行溶
解。
2.6.3.2.取適當量之 DNA溶液以無菌純水做適當倍數之稀釋，分別
測定 260nm及 280nm之吸光值（O.D.）。計算 DNA濃度係
以O.D.260 吸光值乘50ng/μL即為 DNA溶液濃度。 DNA溶
液純度則以 O.D.260/O.D.280比值作判斷，其比值應介於
1.7～2.0間。
2.7.鑑別試驗（註 9）
註 9：PCR 鑑別試驗結果之判讀係以 PCR增幅產物大小判定，當測
試結果判讀困難時，建議進行確認試驗。檢體 DNA之抽取與
製備，其純度將直接影響後續 PCR測試結果，建議抽取之檢
體 DNA可先進行內部對照基因 PCR測試，以確定是否含有DN
A 及其純度。本 PCR定性反應條件係採ABI PRISM 9700設定
之，當使用其他機型時，應自行檢討反應條件。
2.7.1.PCR 操作步驟
以無菌純水適當稀釋 DNA溶液、引子備用。取 PCR反應管，並
依照2.5.5.1.節配製 PCR溶液，依序加入無菌純水、10倍 PCR
緩衝溶液、dNTP、引子、DNA polymerase及 DNA溶液，混合均
勻後，將反應管置於離心機瞬間離心，使混合液聚積於反應管
之底部。移入 PCR反應器，依據引子類別並參照2.7.2.節設定
反應條件，進行反應，結束後，取出 PCR增幅產物，進行電泳
分析。
2.7.2.PCR 條件
───────────────────────────
步驟 溫 度 時 間
───────────────────────────
1.最初變性 95 ℃ 5 min
───────────────────────────
2.變性 95 ℃ 30 sec
3.黏接
測試兔基因 60 ℃ 30 sec
測試哺乳類及家禽類基因 54 ℃ 30 sec
4.延展 72 ℃ 30 sec
步驟 2至步驟 4，共進行40個循環反應。
───────────────────────────
5.最終延展 72 ℃ 7 min
───────────────────────────
2.7.3.膠片電泳分析
取適量之 6倍載入膠片緩衝溶液，分別與無菌純水（空白組）
及 PCR增幅產物混合均勻，注入 2％膠片孔中，以50或 100伏
特電壓進行電泳。同時，必須取 DNA分子量標記物質進行電泳
，作為 PCR增幅產物大小之判別與計算依據。經電泳後之膠片
置入膠片染液中進行染色約15分鐘，續置入水中漂洗及褪染，
再置於紫外燈箱上，以波長 365nm之紫外光照射觀察是否有明
顯之 DNA螢光帶，並判讀結果。每次實驗必須同時測試正反應
及負反應對照組。
2.7.4.鑑別
檢體 DNA之 PCR增幅產物電泳結果，須與正反應對照組及 DNA
分子量標記物質之電泳結果進行相互比對，當檢體 DNA與正反
應對照組 DNA二者皆出現 PCR增幅產物，且經由 DNA分子量標
記物質估算 PCR增幅產物大小為 130bp者，即判定該檢體含有
兔成分。
2.8.確認試驗：本實驗視需要而操作之。
2.8.1.RT-PCR操作步驟
2.8.1.1.RT-PCR－ABI PRISM 7700 Sequence Detector
以無菌純水適當稀釋檢體 DNA溶液、引子及探針備用。取
適量無菌純水，並依照2.5.5.2.節配製 PCR溶液，依序加
入Master Mix、稀釋過之引子及探針，混合均勻後，分裝
20μL 入 PCR反應管中，再各別加入稀釋過之檢體 DNA溶
液5μL，最後將 PCR反應管置於離心機中，以200×g（1,
500rpm）瞬間離心，移入RT-PCR反應器，依下列條件進行
反應。每次實驗皆須製作負反應及正反應對照組。
─────────────────────────
步驟 溫 度 時 間
─────────────────────────
1.熱活化 50 ℃ 2 min
─────────────────────────
2.最初變性 95 ℃ 10 min
─────────────────────────
3.變性 95 ℃ 15 sec
4.黏接、延展
測試兔基因 60 ℃ 1 min
測試哺乳類及家禽類基因 54 ℃ 1 min
步驟 3 至步驟 4，共進行 45 個循環反應。
─────────────────────────
5.冷卻 35 ℃ 45 sec
─────────────────────────
2.8.1.2.RT-PCR－Roche LightCycler
以無菌純水適當稀釋檢體 DNA溶液、引子及探針備用。取
適量無菌純水，並依照2.5.5.3.節配製 PCR溶液，依序加
入 LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization
Probes、稀釋過之引子及探針，混合均勻後，分裝 15μL
於玻璃毛細管中，再各別加入稀釋過之檢體 DNA5μL，最
後將毛細管置於離心機中，以800×g（3,000rpm）瞬間離
心，移入RT-PCR反應器，依下列條件進行反應。每次實驗
皆須製作負反應及正反應對照組。
─────────────────────────
步驟 溫 度 時 間
─────────────────────────
1.最初變性 95 ℃ 10 min
─────────────────────────
2.變性 95 ℃ 5 sec
3.黏接
測試兔基因 60 ℃ 25 sec
測試哺乳類及家禽類基因 54 ℃ 25 sec
4.延展 72 ℃ 8 sec
步驟 2至步驟 4，共進行45個循環反應。
─────────────────────────
5.冷卻 35 ℃ 45 sec
─────────────────────────
2.8.2.RT-PCR螢光分析
檢體 DNA經RT-PCR反應後，直接從RT-PCR反應器上之螢幕觀察
探針所產生之螢光增幅曲線，即可判讀反應結果。每次實驗必
須同時測試正反應及負反應對照組。
2.8.3.確認
檢體 DNA之 PCR增幅產物螢光分析圖須與正反應對照組螢光分
析圖進行相互比對，當檢體 DNA與正反應對照組之 PCR螢光分
析圖，皆出現經由探針所產生之螢光增幅曲線，即確認該 PCR
增幅產物為兔之基因片段，可確認該檢體中含有兔成分。
附註：1.本檢驗方法最低檢測濃度為 0.1％（以乾重計）。
2.本檢驗方法之測試範圍係指能夠抽取出 DNA者之食品，經過高度
加工或不含 DNA之食品不適用於本檢驗方法。
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