貳、實驗方法及結果判定
一、評估對胃腸道功能改善之要點與原則:
(一) 改善胃腸功能必須明確具有以下四種功能指標之ㄧ。
1 促進消化吸收
2 改善腸內細菌菌相
3 幫助 (改善) 胃腸運動
4 有助於胃黏膜之保護作用
(二) 所進行的實驗可分為動物實驗與人體實驗,兩者可擇一施行。
(三) 若廠商所提產品的相關科學研究證據不明確或不足時,須同時進行
「人體實驗」和「動物實驗」,以加強證據之可信度。
(四) 動物實驗進行時間至少需 4 星期以上,人體實驗至少需進行 2
星期以上。
(五) 所使用的實驗動物以哺乳類動物為原則,動物隻數每組至少為 8
隻,小白鼠隻數每組至少為 10 隻。
(六) 實驗動物必須來自各大實驗動物中心。
(七) 人體實驗每組人數至少為 8 人,且必須有控制組。
(八) 人體實驗必須由大學食品、營養、醫藥等相關系所、研究機構、醫
學中心執行,需有醫師參與,並遵循衛生單位對人體實驗有關之相
關規定。
(九) 動物實驗進行時,飼料的內容與比例,必須符合 AIN (American
Institute of Nutrition) 之規範,進行人體實驗的飲食內容與比
例,必須符合衛生署所公布之飲食指南。
(一○) 評估對胃腸道功能所採用的實驗方法,必須是學術界或醫學單位
所採用或普遍認可之方法,亦可使用市售的生化試劑 (Test Kit
) 直接測定之。
二 促進消化吸收
(一) 動物實驗
1 動物體重的測定及消化吸收率的測定
2 消化酵素活性的測定:如 trypsin, chymotrypsin, amylase,
lipase, leucine amino peptidase, disaccharidase。
(二) 人體實驗:
1 有關改善食慾不佳方面,觀察食慾、食量、體重、血紅素等指標
的變化。
2 有關改善消化吸收不良方面,觀察食慾、食量、胃腸腹脹感、糞
便形狀及次數、胃腸運動及小腸吸收等指標變化。
(三) 結果判定:
1 動物實驗中必須至少一項指標為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05
) 。
2 人體實驗方面,如果是針對改善兒童食慾方面,以食慾、食量的
改善為觀察重點。體重及血紅素的變化則作為輔助指標。
3 針對消化吸收不良者,除了有明顯改善食慾、食量,胃腸腹脹感
及糞便形狀等消化不良症狀外,在小腸吸收指標中至少有一項指
標為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) 。
4 如果符合以上要求即可判定測試食品具有促進消化吸收作用。
(四) 測定方法
1 消化酵素活性測定
樣品製備:
截取實驗老鼠 (Sprague-Dawley或Wistar 品系) 小腸片段,刮
下腸黏膜 (脂解酵素活性測定不必刮下腸黏膜) ,取 0.2g 加入
2mL 含 protease 抑制劑 (1 mM phenylmethylsulfonylfluori-
de 及 2.2 mM iodoacetic acid) 之 4℃、0.9% NaCl 溶液,
以均質機均質化。
(1) 雙醣酵素 (disaccharidase) 活性測定
目的:測定小腸雙醣類消化酵素 (乳糖酵素、麥芽糖酵素與蔗
糖酵素) 活性。
測定方法:取 30mL 的腸黏膜均質液加入 15 mL 的 56mM 雙
醣溶液 (乳糖、麥芽糖或蔗糖) 於 37 ℃下作用 30 分鐘,再
加入100 mL 的 0.6 N NaOH 溶液溶解細胞,另以 10mL 的 6
N HCl 溶液中和之。取 45mL 處理過後之腸黏膜液或葡萄糖標
準液 (0-40 mg/mL) 與 625 mL 反應緩衝液 (50 mM Tris-ma-
late、33 mM sodium potassium phosphate 與 30 mM MgCl2
,pH 6.8) 、150 mL 的 1 mM ATP、150 mL 的 1 mM NADP、
15 mL 的 330 IU/mL hexokinase (EC 2.7.1.11) 與 15mL 的
170 IU/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1
.49) 於 37 ℃下作用 30 分鐘,最後將樣品置於冰浴上以終
止其反應。葡萄糖產物含量則以分光光度計於 30 nm 波長下
測定減少的 NADPH ,並以改良的 Lowry 方法測定樣品中蛋
白質含量,而雙醣酵素活性以 mM 葡萄糖/分鐘/㎎蛋白質表
示之。
(2) 脂解酵素 (lipase) 活性測定
目的:測定小腸內脂質消化酵素活性
測定方法:用市售試劑組 (Sigma Lipase-PSa) 測定之。將 9
00 mL 受質溶液 (1.1 mM 1,2- diglyceride、2 mM sodium N
-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine、0.66
mM ATP、860 U/L monoglyceride lipase、1340 U/L glycer-
ol kinase、40,000 U/L glycerol-3-phosphate oxidase、13
40 U/L horseradish peroxidase、40,000 U/L co-lipase 與
緩衝液) 加至 15mL 之腸均質液或標準液 (附於試劑組) 中,
於 37 ℃下作用 3-5 分鐘,再加入 300mL 活化劑 (36 mM
deoxycholate、6 mM 4-aminoantipyrine、0.05% sodium az-
ide 與緩衝液) ,於 37 ℃下作用 3 分鐘後,以分光光度計
於 550 nm 波長下測定2分鐘,並以改良的 Lowry 方法測定樣
品中蛋白質含量,而脂解酵素活性以 unit/mg 蛋白質表示之
。
(3) 白胺酸胺基酵素 (leucine aminopeptidase,LAP) 活性測定
目的:測定小腸絨毛刷狀緣膜上蛋白質消化酵素活性。
測定方法:用市售試劑組 (Sigma Diagnosticsa LAP) 測定之
。取 0.5 mL 腸黏膜均質液,混合 0.5 mL LAP 受質溶液 (20
mg/dL L-leucyl-b-naphthylamine 溶於 phosphate 緩衝液
, pH 7.1) ,於 37oC 下作用 1 小時,再加入 0.5 mL 的
2 N HCl,1.5 mL 處理過後之腸黏膜液或 1.5 mL 標準液 (0-
12 Sigma unit/mL) 與 0.5 mL sodium nitrite 溶液,於室
溫下作用 3 分鐘後,混合 1.0 mL 0.5% (w/v) ammonium s-
ulfamate ,於室溫下作用3分鐘,再加入 2.0 mL N-1-naph-
thylethylenediamine 酒精溶液,於室溫下作用 45 分鐘後,
以分光光度計於 580 nm 波長下測定吸光值,並以改良的 Lo-
wry 方法測定樣品中蛋白質含量,而白胺酸胺基之酵素活性以
Sigma unit/mg 蛋白質表示之。1 Sigma unit 定義為於 37
℃、pH 7.1 下,每 1 小時生成 1 mmole b-naphthylamine
的酵素量。
判定:以上各一項有改善,表示有改善胃腸消化之功能。
2 改善胃腸功能之參考指標:
(1) Lundh 測試 (主要為胰臟功能) :
使用 300 ml 之流質食物 (含 6 %脂肪、5 %蛋白質及 15
%醣類) ,並放置十二指腸管,依時段抽取十二指腸液,以測
定消化酵素之濃度 (如 Trypsin) 或以內視鏡抽取胰液作消化
酵素之分析。
(2) Schilling 測試 (主要為胃腸功能)
-以維生素 B12 之吸收來測定胃腸功能
-以放射性標示之維他命 B12 給予空腹之受試者
-一小時後再由肌肉注射未標示 B12
-24 小時後收集尿液,並測定 B12 含量
-7 天後重複此步驟,但口服 B12 則加入Intrinsic factor
-兩次檢查加以比較評估
(3) 脂肪之吸收判定:
糞便脂肪分析:
-正常值:< 7g/day
-每日食用食物中至少有 100 g 中鏈三酸甘油酯共三天;並
收集糞便 3 天
-測定糞便中脂肪含量
-使用 Sudan stain ,只可測三酸甘油酯及 lipalytic pr-
oduct
(4) D-xylose 耐受測試 (主要為小腸功能) :
-主要測定近端小腸之醣類吸收
-隔夜禁食,再服用 25g 之 D-xylose ,5 小時後之尿液中
若 xylose 排出大於 25 %,即表示正常。
-1 及 2 小時抽血,若其中一次大人血中 xylose>300 mg/L
,或小孩血中 xylose >100 mg/L ,則表示正常。
(5) 核子醫學檢查
目前只使用於 gastric emptying study
-受試者服下含有放射源 (Tc-99m and In-111) 的固體及液
體食物
-測量受試者 90 分後的胃排空率
(6) 放射線科檢查
小腸排空速度檢測
-受試者喝下 600 cc barium 後,隔 15 分透視一次,直到
barium 完全排出ileocecal valve
三 改善腸內細菌菌相
(一) 動物實驗:
1 檢測 1 種益生菌:Bifidobacterium
2 檢測 1 種有害 (或無益) 菌:Clostridium perfringens
(二) 人體實驗:
1 檢測 1 種益生菌:Bifidobacterium
2 檢測 1 種有害 (或無益) 菌:Clostridium perfringens
(三) 測定方法:
1 腸內細菌菌相
(1) 材料
a 大白鼠:雄性 Spraguae Dawley (SD) 或 Wistar 系統大
白鼠之盲腸或糞便。
b 人體糞便。
培養基
a 雙叉桿菌 (Bifidobacteria) 參考培養基:
(a) Bifidobacteria iodoacetate medium -25 (BIM-25)
(b) MPN medium
(c) Beerens medium
b 產氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens) 參考培養基
Tryptose-sulfite-D-cycloserine (TSC) agar
有關製備請參考各相關參考文獻。
(2) 方法
a 取樣及均質
(a) 動物實驗:以按摩方式收集糞便於密閉容器內 (維持厭
氧狀態) ,再於厭氧操作箱內秤取約 0.5 g,加入含 4
.5 mL 無菌厭氧稀釋液 (附註) 之試管中 (內含 5 粒
玻璃珠) ,以試管震盪器混合。
(a) -1 大白鼠經餵養試驗後,麻醉,解剖,在厭氧狀況取
出盲腸 (cecum) 內容物,秤取約 1 g,加入含 9 mL
無菌厭氧稀釋液之試管中 (內含 5 粒玻璃珠) ,以試
管震盪器混合。
(b) 人體試驗:收集糞便於密閉容器內 (維持厭氧狀態) ,
再於厭氧操作箱內,進行如同上述大白鼠樣品之秤重及
均質操作。
2 稀釋及微生物平板分析
於厭氧狀況下,上述均質液以厭氧稀釋液進行一系列十倍稀釋。
取適當稀釋倍數,以表面塗抹法 (spread plate method) 或混
稀平板法 (pour plate method) 加入雙叉桿菌培養基中,置於
厭氧操作箱或厭氧缸中 (內含厭氧包,或抽氣維持厭氧狀態) ,
於 35~37 ℃培養,計數菌落數。
至於產氣莢膜梭菌之計數,請依照美國 FDA 發行的 Bacterio-
logical Analytical Manual (BAM) 。
3 統計分析
實驗數據經統計變異數分析 (Analysis of variance ANOVA) 測
試各實驗組間是否有差異,若有差異再以鄧肯氏多變試驗 (Dun-
can,s multiple range test) 作進一步分析,以決定各實驗組
在 95 %可信度內是否有差異。
(四) 結果判定
動物實驗:若盲腸或糞便的 bifidobacteria 明顯增加,以及 Cl-
ostridium perfringens 減少或無明顯變化者,則稱之具改善腸內
細菌相功能。
人體試驗:若 bifidobacteria 明顯增加,以及 Clostridium pe-
rfringens 減少或無明顯變化者,則稱之具改善腸內細菌相功能。
附註:厭氧稀釋液之製備如下:
Gelatin 0.2 g
Distilled water 50 mL
Salts solution (如 2.1.3 中 salts solution 配方) 50 mL
Resazurin solution (25 mg/100 mL H2O) 0.4 mL
將各成分混合,煮沸,冷卻,再加入 0.05 g cysteine,以厭氧操
作分裝入試管中,每一試管裝 9 mL ,以 121 ℃殺菌 15 min ,
殺菌完成或實驗過程呈粉紅色,請勿使用。
四 幫助 (改善) 胃腸運動,促進腸道正常機能之維持
(一) 動物實驗:
1 胃腸運動 (活性碳、腸鋇計檢查或核子醫學檢查)
2 胃黏膜保護
3 觀察糞便之乾重、粒數、水分及形狀
(二) 人體實驗:
1 腸運動 (腸鋇計檢查或核子醫學檢查)
2 觀察排便時間,糞便重量、水分及形狀及排便感覺之變化。
(三) 檢查方法
胃腸運動測定:
1 動物實驗
(1) 離體實驗:擷取絕食老鼠之胃或腸片段約 1-2cm ,放於組織
浴 (organ bath) 中並通氣之 (95%O2,5%CO2) ,放置 2hr
使其穩定而後做等長收縮 (0.5-1 gm) ,視測試食品對於胃或
腸片段之收縮情況,若實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,即
可判定,即可判定測試食品具有改善胃腸運動之功能。
(2) 活體實驗:動物配置的灌胃溶液灌食 (含有 10 %活性碳及測
試物) 。而後追蹤計算排空率,活性碳則以黑色易觀察之特性
作為胃腸排空之另一指標。 30 分鐘後,大白鼠去頭犧牲,隨
後剪開腹腔以線綁住賁門處,將胃、小腸完整取出,計算胃腸
排空率,方法如下:
charcoal marker
Charcoal Transit=──────────× 100%
Intestinal length
2 人體實驗
(1) 核子醫學檢查:目前只使用於 gastric emptying study
-讓病人服下含有放射源 (Tc-99m and In-i11) 的固體及液
體食物
-測量病人 90 分後的胃排空率
(2) 放射線科檢查:小腸排空速度檢測
-請病人喝下 600 cc 鋇鹽 (barium salt) 後,隔 15 分透
視一次,直到鋇鹽完全排出迴腸辮 (ileocecal valve) 。
(四) 結果判定:糞便重量或粒數明顯增加,再加上胃腸運動實驗或排便
時間中有任何一項結果為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,即可
判定測試食品具有潤腸通便之功能。
五 有助於胃黏膜之保護作用,維持腸道正常機能
(一) 實驗內容:
1 離體實驗:培養鼠胃黏膜細胞,先將測試物至於胃黏膜細胞內,
培養 2 小時,而後置入酸性培養液 (pH=4) 或含 indomethac-
in 之培養液下。測定胃黏膜細胞之存活率 (viabiliy) 的變化
(MTT assay) ,若實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,即可判
定測試食品具有保護作用之功能。
2 活體實驗:胃酸的分泌測定:Shay 潰瘍法 (Shay's ulcer)
雄性實驗絕食老鼠 (24 小時) ,胃部幽門結紮,再予以縫合復
原,俟 4 小時候,將其犧牲取出胃部,收集胃液並定量胃液體
積,並以 01N NaOH 溶液滴定,求其實驗組及控制組之總酸度之
變化若 p<0.05 ,即可判定測試食品具有胃黏膜保護作用之功能
。
(二) 結果判定:任何一項結果為實驗組明顯優於控制組 (p<0.05) ,
即可判定測試食品具有幫助胃黏膜保護之功能。
六 減少胃內幽門螺旋桿菌
(一)受試者的篩選
1 志願參與者先填寫一份問卷,包括個人飲食、生理習慣及健康狀
況(含是否有慢性病,需要隨時服藥等)。
2 體檢,包括醫生問診、體位測驗、及血液生化檢查(含血紅素、
血球比容、血糖、血脂肪、肝功能及腎功能)。
3 依據前兩項的資料,篩去習慣特異及健康不良的參與者。然後填
寫志願書,進行尿素呼氣試驗(urea breath test),以得 13
CO2 /12CO2 比值(即ΔUBT 值)。就ΔUBT 值決定受試對象(
建議ΔUBT>10%O 者)。
(二)實驗方法
1 受試者在實驗開始前三週每四天測一次ΔUBT 值,以觀察其日常
飲食是否影響該值;並計算其平均值,以作為實驗開始後的比較
。
2 每位受試者於實驗前必須接受飲食指導。實驗開始前須經 2~3
週之穩定期,於穩定期間應按其個人之原飲食習慣攝食,並避免
暴飲暴食或其他特殊食物之攝取,且亦不可服用整腸健胃藥物、
補充劑、抗生素、組織胺-2 拮抗劑、抗氧化劑、強調整腸健胃
的機能性食品,或其他不明藥物等。並於該其間進行幽門螺旋桿
菌之測試,而獲得至少最後之 3 次為近似恆定值,其平均值作
為實驗之起始值(initial value) 。
3 實驗期間(最少二週)的飲食按上述穩定期間之條件進食,且加
食試驗品穩定與實驗期間定期測量其ΔUBT 值、血液生化檢查、
體檢、與問卷調查,以瞭解其實驗期間健康情形及身體的感覺。
4 ΔUBT 值測定:受試者在受試前一天晚上 10 點以後禁食,次晨
刷牙、漱口,靜坐 5 分鐘後飲用 200 mL 的 0.1N 檸檬酸溶液
,漱口、靜坐 10 分鐘後,吹氣至 2 支 10 mL 的氣體收集管
。再靜坐 5 分鐘後飲用 50 mL 含 13C 標識的尿素(50mg)
溶液,再漱口、靜坐 10~20 分鐘後,吹氣至 2 支 10mL 的氣
體收集管。所收集的氣體以 isotope ratio mass spectrometer
(IRMS)分析其ΔUBT 值。
(三)結果判定
1 若受試者之ΔUBT 值於實驗後比實驗前有明顯(p<0.05) 降低
,則表示該試驗品具有減少幽門螺旋桿菌之生理功能。
2 經體檢及問卷調查結果,若於實驗期間及實驗後一週沒有明顯不
舒服的感覺或其他健康問題,特別是腸胃道問題,則可判斷該試
驗品沒有安全上的問題。
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