一、定義：
    本檢驗方法係針對動物傳染病分類表中的牛布氏桿菌病（Bovine bru
    cellosis）及羊布氏桿菌病 （Caprine and ovine brucellosis）而
    定。
  （一）生體檢查之血清學檢驗以玫瑰苯試驗（Rose bengal test，以下
        簡稱RBT）為初驗，RBT呈現陰性反應之血清樣本直接判定為陰性
        ，RBT呈現陽性反應之血清樣本則須進行補體結合試驗（Complem
        ent fixation test，以下簡稱CFT）作為複驗，並以 CFT結果作
        為最終判定。
  （二）流產胎兒之胃內容物、組織和胎膜以及母體陰道分泌物等則以病
        原分離鑑定結果為依據。

二、玫瑰苯試驗（Rose bengal test, RBT）
  （一）檢驗試劑：
        1.標準陽性血清：依世界動物衛生組織（以下簡稱 OIE）規定所
          生產之商品化陽性血清。
        2.RBT使用之抗原：依OIE規定所生產之商品化抗原。
  （二）操作步驟：
        1.將RBT使用之抗原、標準陽性血清（對照用，每天檢驗前做1次
          即可，步驟同待測血清）及待測血清回溫至22 ± 4℃。
        2.將血清各25-30μl置於適當之玻璃板（白瓷板或塑膠板亦可）
          上。
        3.將 RBT使用之抗原溫和搖勻，滴與血清等量（25-30μl）之抗
          原於血清之一側。
        4.以塑膠棒或玻璃棒將抗原及血清充分混勻，使成直徑約 2cm圓
          形或橢圓型混合液。
        5.溫和搖晃玻璃板使混合液充分混合約 4分鐘後判讀。
  （三）檢驗結果判讀：
        1.任何可見之凝集都視為陽性反應（如圖 1）。
        2.標準陽性血清需為陽性反應，否則需重複進行試驗。
        3.待測血清樣本若為陽性反應，須進行 CFT作為複驗；若無陽性
          反應，則直接判定為陰性。

三、補體結合試驗（Complement fixation test, CFT）：
  （一）檢驗試劑：
        1.CFT使用之抗原：依 OIE規定生產之商品化抗原。
        2.CFT使用之緩衝液（CFT buffer）：依 OIE推薦。
        3.補體：商品化冷凍乾燥之天竺鼠補體粉末，以無菌水回溶後分
          裝保存於-70℃。力價測定方法為將連續稀釋之補體液25μl加
          入50μl CFT buffer及50μl致敏化紅血球，於 37± 2℃30分
          鐘作用後，產生50％溶血之補體力價稱為 1單位，試驗使用之
          補體力價為 6單位，每批補體皆需測試。
        4.溶血素：抗綿羊紅血球之兔抗血清，添加無菌水 2ml回溶。
        5.致敏化紅血球：新鮮綿羊紅血球以 CFT buffer稀釋成3％，以
          等體積之CFT buffer（含適當比例之溶血素）混勻，於5±3℃
          感作一夜後完成。此致敏化紅血球在 1單位補體作用下可產生
          50％溶血，每批致敏化紅血球皆需測試。
  （二）操作步驟：
        1.將所需之試劑及待測血清回溫至22±4℃。
        2.取標準陽性血清及待測血清各 40μl加入CFT buffer 40μl，
          於58±2℃作用50分鐘，各加入80μl CFT buffer成4倍稀釋血
          清。
        3.使用96孔標準「U」型盤進行實驗，每血清使用一列8個孔，第
          1至8孔（除第2孔外）預先加入 CFT buffer 25μl。
        4.將25μl稀釋血清分別加於第1至3孔，第1孔為抗補體檢驗孔。
        5.第3孔以微量吸管混勻後吸出 25μl加於第4孔，以此法連續兩
          倍稀釋至最後第8孔，最後第 8孔吸出之25μl丟棄。因此，稀
          釋倍數由第2至8孔依序為4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、 128
          倍及256倍。
        6.將25μl CFT使用之抗原依序加於第2孔至最後第8孔。
        7.將25μl補體依序加於第1至8孔，最終每孔體積為75μl。
        8.96孔盤置於振盪器震盪2分鐘後，37±2℃作用30分鐘或5±3℃
          隔夜充分感作。
        9.將致敏化紅血球回溫至22±4℃。
       10.每孔添加50μl致敏化紅血球，96孔盤置於振盪器震盪2分鐘後
          ，37±2℃作用30分鐘。
       11.移回 5±3℃ 2～3小時或於5±3℃下 1000g離心10分鐘，讓未
          溶解血球沉澱。
  （三）對照組製備：
        1.完全溶血、50％溶血及不溶血對照之製備：完全溶血對照係取
          50μl致敏化紅血球溶液經3次冷凍、解凍，加入75μl CFT bu
          ffer即成。50％溶血對照係取25μl致敏化紅血球溶液經3次冷
          凍、解凍，加入 25μl致敏化紅血球溶液及75μl CFT buffer
          即成。不溶血對照係將致敏化紅血球溶液50μl加入75μl CFT
           buffer而成。
        2.製備補體對照組：補體25μl加 CFT buffer 50μl，再加致敏
          化紅血球溶液50μl。
        3.製備抗原對照組：抗原25μl、補體25μl及CFT buffer 25μl
          ，再加致敏化紅血球溶液50μl。
  （四）檢驗品質管控：
        1.對照組之品質控制：不溶血對照組應不溶血（如圖 2左），補
          體對照組及抗原對照組應完全溶血（如圖 2右），若不符合此
          預期，需重新檢驗。
        2.每列第 1孔抗補體檢驗孔如出現非完全溶血，顯示有抗補體反
          應，試驗需重新進行；若試驗重測後仍有抗補體反應，則需重
          新採取血清樣品。
        3.標準陽性血清抗體力價應高於64倍，否則需重複進行試驗。
  （五）檢驗結果判讀：
        1.與溶血對照組比較，當每列出現不溶血至50％溶血（如圖 2中
          ）判為陽性，50％溶血至完全溶血判為陰性。每列產生陽性之
          最高稀釋倍數即為血清之抗體力價。
        2.血清抗體力價小於4倍判定為陰性；抗體力價等於或大於4倍判
          定為陽性；但初次送檢及重新採樣之血清樣本皆為 CFT抗補體
          反應則亦判定為陽性。

四、病原分離鑑定：
  （一）適用檢體種類：新鮮流產胎兒之胃內容物、脾臟或肺臟，新鮮胎
        膜，以及母體陰道分泌物等。
  （二）試劑： OIE推薦之選擇性培養基。
  （三）操作步驟：
        1.臟器組織先做成乳劑再以釣菌環取樣，胃內容物和陰道分泌物
          等則直接取樣，塗抹於選擇性培養基。
        2.以37± 2℃、5-10％ CO2培養。
        3.約 3-4天後觀察是否有菌落生長。培養物在7-10天後若為陰性
          才可丟棄。
        4.可疑菌落以 API 20E商品化生化套組鑑定。
  （四）結果判定： API 20E商品化生化套組鑑定結果為Possibility of
        Brucella spp.，即判為陽性。