一、方法概要：
本方法係以多管發酵方式檢驗水中兼性厭氧、革蘭氏染色陽性之糞生
鏈球菌群細菌。該群細菌之菌株具有陰性過氧化氫的反應，並能在疊
氮葡萄糖培養液（Azide Dextrose Broth）中生長，且於膽汁馬栗樹
糖疊氮培養基（Bile Esculin Azide Agar） 上能形成棕黑色或暗紅
色菌落。
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二、適用範圍：
本方法適用於水中糞生鏈球菌群之檢驗，但不適用於含有干擾物質（
如：毒性物質等）的水樣。
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三、干擾：
（一）水樣中含有抑制或促進糞生鏈球菌群細菌生長之物質。
（二）檢驗使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進糞生鍵球菌群細菌生
長之物質。
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四、設備：
本方法中使用的各種器皿均應經滅菌處理：
（一）採樣容器：無菌的硼矽玻璃或塑膠容器，亦可使用無菌袋。
（二）稀釋瓶：能耐高溫高壓滅菌之有蓋硼矽玻璃或塑膠製品，但不可
以使用棉花塞當蓋子，一般有100mL刻度者。
（三）量筒：一般使用10mL、25mL、50mL及100mL之量筒。
（四）吸管：一般使用1mL、5mL及10mL之玻璃或無菌塑膠製品，應有0.
1mL之刻度。
（五）三角錐度：硼矽玻璃製品， 100mL、250mL、500mL或1000mL，可
作為混合培養基的容器，且方便儲存者。
（六）培養皿：直徑 9㎝之硼矽玻璃或可拋棄式塑膠製培養皿。底面平
滑無氣泡、刮傷或其它缺點者。
（七）試管：大小約150×15㎜之試管或有蓋螺旋試管。
（八）培養箱：溫度能保持在35±1℃者。
（九）高壓滅菌釜：用於稀釋液、培養基及不能乾熱滅菌之材料、實驗
用具的滅菌。能以121℃（約151b/in2或1㎏/㎝2）滅菌15分鐘以
上者。
（十）乾熱滅菌器：用於玻璃器皿之滅菌。溫度能保持在160℃、2小時
或170℃、1小時以上者。
（十一）水浴槽：能維持水溫溫差在±0.5℃以內者。
（十二）接種環：為白金或鎳鉻合全製，能適用於細菌接種或移植者。
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五、試劑：
（一）培養基：
1.疊氣葡萄糖培養液：
每一升之疊氮葡萄培養液含下列成分：
牛肉抽出物（Beef extract） 4.5g
胰化蛋白（Tryptoneorpolypeptide ） 15.0g
葡萄糖（Dextrose） 7.5g
氯化鈉（Sodiumchloride） 7.5g
疊氮化鈉（Sodiumazide ） 0.2g
蒸餾水（Distilled water） 1.0L
經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，最後 pH 值調為 7.2 ± 0.2 。
2.膽汁馬栗樹糖疊氮培養基
每一升之膽汁馬栗樹糖疊氮培養基含下列成分：
酵母抽出物（Yeast extract ） 5.0g
三號蛋白（Proteose peptone No.3 ） 3.0g
胰化蛋白（Tryptone） 17.0g
牛膽粉（Oxgall powder） 10.0g
馬栗樹糖（Esculin） 1.0g
檸檬酸鐵銨（Ferric ammonium citrate ） 0.5g
氯化鈉（Sodium chloride ） 5.0g
疊氮化鈉（Sodiumazide ） 0.15g
瓊脂（Agar） 15.0g
蒸餾水（Distilled water） 1.0L
經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，最後 Ph 值為 7.1 ± 0.2 。
3.腦－心浸出培養液（BHI )
每一升之腦－心浸出培養液含下列成分：
牛腦浸出物（Calf brain infusion ） 200.0g
牛心浸出物（Beef heart infusion ） 250.0g
蛋白（Proteose peptone） 10.0g
氯化鈉（Sodium chloride ） 5.0g
磷酸氫二鈉（Disoduim phosphate） 2.5g
蒸餾水（Distilled water ） 1.0L
經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，最後 pH 值為 7.4 ± 0.2 。
（二）稀釋液：
1.磷酸二氫鉀溶液：
取 3.4g 磷酸二氫鉀溶於 50mL 之蒸餾水中，俟完全溶解後，
以1 .0N 氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為7.2 ± 0.5。然後加蒸
餾水至全量為 100 mL ，儲存於冰箱中作為原液備用。
2.氯化鎂溶液：
取 8.1g 氯化鎂（MgCl2‧6H2O ），先溶於少量蒸餾水中，俟
完全溶解後，然後加蒸餾水至全量為 100 mL ，儲存於冰箱中
作為原液備用。使用時分別取 1.25mL 磷酸二氫鉀溶液及 5.0
mL 氯化鎂溶液混合，再加蒸餾水至全量為 1,000 mL ，混搖
均勻後，分裝於稀釋瓶中，經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘以上，作
為稀釋液備用。
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六、採樣與保存：
（一）採樣：
1.採樣時，必須使用清潔並經滅菌之容器或無菌袋，及溫度能維
持在0至5℃之樣品儲存設備。
2.水樣如果有餘氯時，在採樣時應加入適量硫代硫酸鈉溶液（如
在120mL的水樣中加入0.1mL10％的硫代硫酸鈉，可還原15㎎/L
的餘氯）。
3.所採取之樣品應具有代表性，且在檢驗之前不再被污染。
（二）保存：
1.水樣運送及保存之溫度應維持在0至5℃。
2.樣品自採樣後至進行檢驗，其保存時間不得超過24小時。
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七、步驟：
水樣取回後，先進行水樣稀釋步驟，分別使用滅菌過之吸管依序做成
一系列適當之10倍、100倍、1,000倍、10,000倍等稀釋水樣，並混搖
均勻。進行每一稀釋步驟時，應取10毫升水樣（或稀釋水樣）至90毫
升無菌稀釋水中，其稀釋方法如圖一所示。
試驗分別兩部分：
（一）擬定試驗（Presumptive Test）
1.取1mL適當稀釋水之水樣接種於一連串含9mL疊氮葡萄糖培養液
的試管中，做三連續稀釋度各五重複（若水樣量太少則做三重
複），測試最大可能數（Most Probable Number;MPN）。
2.在35±1℃ 培養24至48小時，觀察有無微生物生長（利用吸光
度計算法），若有混濁現象，則擬定試驗為陽性反應，續做確
認試驗。
注意：若所取稀釋度之水樣量為10mL，培養基之配置濃度須為建
議量的兩倍。
（二）確認試驗（Confirmed Test）首先進行擬定試驗，若擬定試驗的
結果為陽性反應，則繼續進行第二部分之確認試驗。
取上述有微生物生長的培養液，以接種環自試管中接種一圈液體，並
塗抹於膽汁馬栗樹糖疊氮培養基上，在 35±1℃下培養24小時，觀察
有無棕黑色或暗紅色菌落形成，若有，則判定確認試驗為陽性反應。
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八、結果處理：
（一）由上述方法所得結果應以「最大可數 （MPN）」計算及記錄，以
三種連續稀釋度各做五重複的 MPN可自表二中查出，表中附有95
％可信度值。
（二）表二中所示之水樣量為10mL、1mL及0.1mL，若實際接種之水樣量
為1.0mL、0.1mL及0.01mL時，應將由表中對應查出數字乘10倍：
若用 0.1mL、0.01mL及0.001mL時，則應乘100倍，其餘依此類推
。
（三）如果檢測時的稀釋度超過連續三次，應採用其中最具意義的三種
稀釋度。以表一為例。
（四）100mL水中糞生鏈球菌群最大可能數（MPN）之計算公式如下：
查表所得之 MPN 值
100mL 水中糞生鏈球菌群最大可能數＝─────────
（MPN/100mL） 最具意義之三種稀釋
倍數之中間水樣體積
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九、品質管制：
如果樣品中懸浮顆粒過多而造成吸管堵塞時，請先將樣品用攪拌器（
Blender）攪拌。
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十、精密度及準確度：
（一）多管發酵法之結果在統計上的可靠性比濾膜法低，但可用多次水
樣檢驗以提高其準確度。例如每 1mL水中含有一個糞生鏈球菌群
細菌時，依據逢機分佈的理論：若以 1mL的水樣做檢驗，有37％
的機率為非陽性反應，但是以重複五支試管做檢驗，全部試管均
為非陽性反應的機率低於1％。
（二）以五重複之試管，10mL、1mL、0.1mL之三連續稀釋度所得陽性反
應試管數組管，其對應之MPN指數，其 95％可信度值如表二中所
列。
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十一、參考資料：
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