一、方法概要
水樣經玻璃纖維濾紙過濾後,於 90 %丙酮中以組織研磨器研磨萃取
其中之葉綠素 a,再以藍光光源的螢光儀測得螢光值,最後依螢光值
計算水樣中葉綠素 a 含量。
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二、適用範圍
本方法適用於地面水體、飲用水水源水質及海域地面水體等水中所含
葉綠素 a 之檢測。本方法之偵測極限估值為 0.11 μg/L 。
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三、干擾
(一)萃取物如產生紅色光區的螢光會干擾葉綠素a的量測。
(二)樣品中其他葉綠素或胡蘿蔔素濃度過高會有螢光熄滅效應,應將
樣本作稀釋以克服之。
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四、設備及材料
(一)量筒:使用100、500或1000mL之量筒。
(二)玻璃纖維濾紙:直徑為47mm或25mm,孔徑約0.7μm(Whatm-an
GF/F或同等級產品)。
(三)過濾裝置:薄膜過濾裝置。
(四)真空抽氣裝置:水壓式、吸氣式或手動式,壓力差低於
0.2kg/cm2(=20kPa)者。
(五)鑷子。
(六)錫箔紙。
(七)存放盒:能遮光,在運送過程及儲存時,可以存放含過濾樣本之
濾紙者。
(八)運送儲存器:運送過程不超過4小時,用維持在0-4℃的儲存器如
旅行冰箱內加放冰塊;若超過4小時,則需存放在低於-20℃的儲
存器內如液態氮桶、乾冰桶或冰箱之冷凍櫃。
(九)冷凍櫃:可長期維持在-20℃以下的儲存器。
(十)離心管:錐形底、15mL,具螺紋蓋。
(十一)離心機:懸臂式、可以容納15mL錐底離心管、轉速可達675g以
上。
(十二)定量瓶:10、25、50或100mL褐色定量瓶。
(十三)移液管:0.5、1、2、3、4、5或10mLA級玻璃移液管。
(十四)恆溫水浴槽:循環式。
(十五)分光光度儀:狹縫寬度(bandwidth)小於2.0nm,靈敏度達
0.001。
(十六)螢光光度計:激光波長436nm,放射光波長680nm,光源為藍光
(Turner Designs Mode l10AU激發濾鏡436FS10及放射濾鏡
680FS10或同等級產品)。
(十七)研磨機:具組織研磨效果者。
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五、試劑
(一)試劑水:水經蒸餾後通過陰離子與陽離子交換樹脂的水,其導電
度在25℃為0.056μmho/cm。
(二)丙酮:層析級。
(三)葉綠素 a標準品:不含葉綠素b(Sigma ECNo207-536-6或同等級
產品)。
(四)90%丙酮水溶液:以量筒量取 100mL試劑水置於1L燒杯或儲存瓶
中,再以量筒量取 900mL丙酮,倒至上述燒杯或儲存瓶中,混勻
後標誌清楚。
(五)葉綠素 a儲存液:買來的固體標準葉綠素a,必須存放在低於-20
℃黑暗處。葉綠素 a標準儲存液配製時,輕輕敲打玻璃瓶,使固
體標準葉綠素 a均集中在瓶底,然後在暗處將瓶蓋打開,將瓶中
所有的固體葉綠素 a倒至50mL的量瓶中,以90%丙酮水溶液稀釋
之,貼上標籤,包上錫箔紙,以避光。依下述八、結果處理(二
)之分光光度計方法定量之,並將剩餘的溶液裝入密封的容器內
,存放在低於-20℃黑暗處,可保存6個月,每次使用前均必須以
分光光度計再行定量。
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六、採樣及保存
(一)視水中浮游藻類密度而定,採取代表性水樣約100至4000 mL,並
記錄採樣體積、採樣時間及地點等。
(二)採樣後將水樣混合均勻,量取適量水樣(視水樣而調整),立即
進行過濾濃縮。水樣濾至接近抽乾時,關閉真空抽氣部分(壓力
不得超過0.2kg/cm2或20kPa),以避免過度抽乾;過濾時間不得
超過10分鐘。過濾之水樣量以使濾紙呈微帶綠色或褐色者為佳。
以鑷子移去濾紙,將含顆粒物質的那一面朝內一摺,並用吸水紙
將過多的水分吸乾,再將濾紙置放於適當的容器內。若無法立即
萃取,應將存放濾紙的容器以錫箔紙包裹避光,存放在 -20℃以
下的冷凍櫃,但運送過程中可暫時(2至4小時)存放在冰桶(0-
4℃)或液態氮桶中。
(三)過濾的濾紙若保存在低於 -20℃冷凍櫃中,保存期限不可超過一
個月。
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七、步驟
(一)檢量線之製作每兩個月須做一次檢量線,但如果儀器有調整或更
換燈管、濾鏡或其他光學零件時須重新製作檢量線。製作檢量線
時,先取葉綠素 a標準儲存液至定量瓶中,以90%丙酮水溶液稀
釋之,配製 5種不同濃度的標準稀釋液,使用前才配製。分析前
先以90%丙酮水溶液分別對分光光度計(波長664.3與750nm)與
螢光儀歸零,再將五種濃度的標準溶液分別測吸光值與螢光值,
吸光值經八、結果處理(二)之公式算得葉綠素 a含量,以此含
量值作檢量線,來校正螢光儀之測值。
(二)葉綠素a之萃取和測定
1.如果濾紙存放在冰箱中,取出至暗處回溫。將研磨器架設好,
工作台的燈光調至能供儀器操作之最低光度。將濾紙移入研磨
器內,移入前可將濾紙剪成小片狀,以玻棒將濾紙推到研磨器
底部,加入 4mL90%丙酮水溶液,研磨成泥狀(注意:研磨過
程不可過熱)。以6mL 90%丙酮水溶液潤洗研磨器及研磨棒後
,將潤洗液與泥狀物混合置於離心管內,旋緊螺紋蓋震盪混合
,在 4℃暗處,直至下一個步驟-離心。處理下一個濾紙前研
磨管棒及其管需用裝有丙酮和水溶液的洗滌瓶清洗,以去除任
何殘留在研磨器具上的物質,最後必須再以丙酮潤洗,才進行
下一個樣品。
2.將研磨好的樣品,充分混合後置於4℃暗處浸泡至少2小時,但
不得超過24小時,在此過程中至少應從 4℃暗處取出震盪混合
一次。
3.浸泡完成後,取出震盪混合之,以水浴回溫至室溫 3分鐘,以
675g離心15分鐘或是 1000g離心10分鐘,取其上澄液,進行下
一步驟,螢光光度值的分析。
4.以螢光儀測樣品之螢光值,依檢量線推算其葉綠素 a含量。當
螢光值超過所製作的檢量線最高濃度之測值時,須加以稀釋,
直至落在檢量線範圍內。
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八、結果處理
(一)樣品葉綠素a濃度之測定:樣品之螢光儀測值經由檢量線可求得
葉綠素a之濃度(μg/L)。依下式計算水樣中葉綠素a之濃度:
A × V
水樣中葉綠素 a 的含量 (μg/L) 為=────
10
A :由檢量線求得之葉綠素 a 濃度 (μg/L)。
V :使用之原水樣體積 (mL) 。
(二)用分光光度計分析標準品稀釋液之葉綠素a濃度時,先以90%丙
酮水溶液將分光光度計歸零,然後在波長664.3與750 nm測定其
吸光值,分別得Abs664.3和Abs750,再依下式計算葉綠素a濃度
:
(Abs664.3-Abs750) × 106
標準品之葉綠素 a 濃度 (μg/L)=────────────
(87.67 × 樣品槽的光徑)
以計算所得之標準品葉綠素a濃度作檢量線。
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九、品質管制
(一)萃取和測定過程必須在弱光下進行﹐並使用不透明容器以避免葉
綠素a分解。
(二)所有的光合色素對光線及溫度都很敏感,所有試驗過程必須在低
光度下進行;所有的標準品、品質管制樣品及過濾後的樣品必須
保存在-20℃以下黑暗環境中,以避免降解。
(三)檢量線製作:每批次樣品應重新製作檢量線,並螢光測值與分光
光度計推算的葉綠素濃度做相關係數(R值)。R值應大於或等於
0.99。
(四)空白分析值每一批樣品須以一片不含葉綠素a之玻璃纖維濾紙,
依步驟七、(一)與樣品同時做空白分析,同一批樣品萃取過程
中,空白分析須安排在最後一個作萃取,以了解試劑是否有被污
染。
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十、精密度及準確度表一為單一實驗室對不同樣品進行2小時與24小時萃
取時間的精密度。
表二為單一實驗室針對二種不同藻種過濾不同體積量的準確度。
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十一、參考資料
(一)行政院環境保護署環境檢驗所水中葉綠素a檢驗方法-丙酮萃
取法。NIEA E507.01T﹐1994.。
(二)US EPA Method 445.0. In vitro determination of chlorop
hyll a and pheophytin a in marine and freshwater algae
by fluorescence. 1997.
(三)Welschmeyer, Nicholas, A., Fluorometric analysis of
chlorophyll a in the presence of chlorophyll b and
pheopigments. Limnol. Oceanogr. 39(8), 1985-1992,
1994.
註:操作安全注意事項
1.本方法所使用各種試劑之毒性或致癌性並不明確,但可能對
人體健康有害,故應儘量避免可能的曝露。檢驗室應有勞工
主管機關對於各化合物之安全操作規定,並將有關資料分送
實驗人員。
2.在進行研磨萃取濾紙時,應在抽風櫃中操作,以減少操作人
員吸入太多量之丙酮。
3.實驗室人員應減少或消除廢棄物的量或毒性,本檢測方法產
生之廢液,依丙酮廢液處理原則處理。
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