一、方法概要
    本方法主要係以水蚤（ Daphnia similis）為測試生物，以靜水式生
    物毒性試驗方法，監測水樣之急毒性，並計算48小時之半數致死濃度
    （LC50）。

二、適用範圍
    本方法適用於事業、都市放流水及其他廢污水之急毒性試驗。

三、干擾
  （一）實驗室內使用之有機溶劑或有毒氣體造成水蚤之死亡。
  （二）玻璃器皿及測試容器未清洗乾淨致殘留有毒物質。
  （三）水蚤品種不純。
  （四）其他。

四、設備
  （一）溫度計（ 0～50℃）。
  （二）溶氧測定儀。
  （三）pH計。
  （四）光學顯微鏡。
  （五）比導電度計。
  （六）通氣設備。
  （七）廣口滴管。
  （八）硼砂玻璃燒杯（4L， 500mL，及 100mL）。
  （九）天平：可精稱至 0.1mg。
  （十）4L塑膠桶。

五、試劑及供試生物
  （一）試劑
        1.參考毒物（ Reference toxicants）
         (1)氯化鎘（ CdC12）
         (2)十二烷基硫酸鈉（ Sodiumdodecyl sulfate）
        2.10％硝酸。
        3.丙酮。
        4.稀釋水
          每一公升之去離子水含下列成分（試藥級）：
          碳酸氫鈉                    96.0mg
          硫酸鈣（ CaSO42H20）        60.0mg
          碳酸鎂                      60.0mg
          氯化鉀                       4.0mg
          上述溶液經激烈曝氣數小時後即可使用，其硬度約在80-100
          mgCaCO3/L 。
  （二）供試生物
        1.水蚤品種鑑定本土水蚤（ D.similis），經分離純種培養後，
          在顯微鏡下觀察其特徵（見圖一），其成熟雌蚤的外型酷似大
          型蚤Daphniamagna，冬卵的卵鞍近乎矩形，冬卵的生軸斜向平
          行於卵鞍的背面。唯雌蚤的後腹部並無顯著凹陷的情形，而是
          在後腹部前端靠近 2～ 3根或 3～ 4根處有略分開的情形（見
          圖二）。
        2.水蚤之馴養
         (1)水蚤自採集地區或飼養單位取回後，放入內盛3L稀釋水之4L
            硼砂玻璃燒杯中馴養，每一燒杯內水蚤數不得超過 300隻，
            以避免繁殖太快，造成擁擠。
         (2)為避免水蚤意外造成全部死亡，馴養燒杯需 5個。
         (3)馴養之水溫必須與毒性試驗溫度一致，即25±１℃，光照時
            間應維持每天16小時。光照強度為10～20μE/m2/S。（100-
            200lux）。
         (4)馴養時間至少 7天，水蚤死亡率不得超過 5％。
         (5)馴養杯內溶氧須以通氣設備通氣以維持溶氧在 5mg/L以上。
         (6)馴養時每天清除燒杯底部沈積之食物、殘渣與水蚤排泄物，
            同時每兩天更換50％稀釋水。
         (7)水蚤的食物為小球藻（ Chlorellasp），其餵食濃度應為每
            毫升十萬個細胞以上。
        3.水蚤餌料之製備
         (1)小球藻來源：可向國內有關單位獲得。
         (2)小球藻培養液之製備。
            亦可稱取花寶二號（HYPONeX2,The HYPONeX Corp.,OH, USA
            ）肥料或同級品1.0g，溶解於 1,000mL蒸餾水中。分裝400m
            L 溶液於 500mL錐形瓶，再於 121℃下，加熱滅菌15分鐘。
            待冷卻後，保存於 4℃備用。
         (3)小球藻之培養
            將要培養之純種小球藻接種於含 400mL培養液之 500mL錐形
            瓶中，通氣培養並以１支白色日光燈（ 40W）從上方（距離
            約20cm）加以照光。培養 7天後，小球藻之濃度即可達到1.
            0 × 106細胞／毫升，此時之培養液呈綠色。小球藻之實際
            細胞濃度，可由光學顯微鏡下以血球計數器計數得知。
        3.二十四小時時齡內之測試水蚤製備
         (1)測試前24小時在馴養燒杯內以廣口滴管，挑選成熟水蚤放入
            500mL 之燒杯，內盛 400mL。
         (2)光照時間及餵食條件與馴養時期相同。
         (3)培養一天即可獲得毒性試驗所需之24小時時齡內之水蚤。

六、採樣與保存
  （一）水樣必須在指定之放流口採樣，採集及運送過程中不可曝氣，以
        減少揮發性物質流失，因而使水樣毒性改變。
  （二）水樣原則上，至少應採取代表性水樣一次，進行毒性試驗。
  （三）所採水樣量約為 4公升，採樣後立即保存於暗處及 4℃冷藏裝置
        內，送回實驗室。水樣必須在採樣後36小時內進行毒性試驗。
  （四）在進行毒性試驗前，應先將水樣靜置半小時待粗顆粒沈降後，再
        取上清液測試。

七、步驟
  （一）測試容器之清洗
        1.新的玻璃器皿只需用10％硝酸浸泡一夜後，再用自來水及去離
          子水各沖洗一次即可使用。
        2.已做過毒性試驗之容器則必須依下列步驟清洗
         (1)自來水浸泡15分鐘後，用清潔劑清洗內壁。
         (2)以自來水沖洗二次。
         (3)以10％硝酸清洗容器內部一次。
         (4)以去離子水沖洗二次。
         (5)以丙酮沖洗一次。
         (6)以去離子水沖洗三次。
        3.做毒性試驗前，測試容器再以稀釋水沖洗一次。
  （二）篩選試驗（Screening test）
        1.將 8個 100mL之燒杯分成兩組；一組為對照組，內盛50
          mL稀釋水，另一組為實驗組內盛 50mL100％原水樣。
        2.用廣口滴管將前述已培養之24小時時齡內之水蚤移入燒杯內，
          每個燒杯內各放 5隻水蚤。
        3.觀察24小時內水蚤死亡情形並記錄。
        4.若24小時內對照組死亡率小於10％，實驗組死亡率大於10％，
          則水樣有急毒性，須做進一步確定試驗。
        5.水溫應控制在25± 1℃；測試期間水蚤不須餵食，光照應維持
          每天16小時。
        6.若對照組與實驗組死亡率均小於10％，則水樣每急毒性，不須
          做確定試驗。
  （三）確定試驗（ Definitive test）
        1.確定試驗亦分為對照與實驗兩組，實驗組係將原水樣以稀釋水
          稀釋為 5個濃度，每個濃度稀釋比例以不得低於較高濃度之50
          ％為原則。對照組則為 100％稀釋水。
        2.為易於觀察水蚤活動，每個濃度使用 4個 100mL燒杯做測試容
          器，每個燒杯內置 5隻水蚤，水樣體積為50mL。對照組與實驗
          組之 5個濃度均以20隻、24小時時齡內之水蚤作測試生物。
        3.先將各種濃度水樣及對照組之水樣配製好後，再以廣口滴管將
          所培養之24小時時齡內之水蚤置入測試容器內。
        4.測試期間為48小時，水溫應控制在25± 1℃，測試期間，水蚤
          不須餵食，光照仍應維持每天16小時。
        5.水蚤放入後，每天觀察並記錄水蚤死亡數目，同時每日監測及
          記錄水溫、溶氧、pH、導電度等水質資料。

八、結果處理
  （一）水蚤死亡之判斷
        水蚤運動主要靠第二觸角、胸腳、及後腹部等。當這些器官或部
        位，有明顯不活動，並經過輕敲燒杯亦無反應，即可認定為死亡
        。
  （二）48小時LC50之計算
        毒性解法試驗計算LC50方法有多種，目前常用計算方法共有 4種
        ：
        1.圖解法（Graphic method）
        2.機率單位法（ Probit method）
        3.史丕曼－卡伯法（Spearman-Karber method）
        4.史丕曼－卡伯修正法（ TrimmedSpearman-Karber method）
        上述四種方法之計算與測試水蚤死亡率有關，其方法取捨依附圖
        之流程圖作判斷。（詳細內容請參考十一（四））

九、品質管制
  （一）水蚤之品種必須在光學顯微鏡下經過專家鑑定或由已確定為本種
        之飼養單位獲得，不可混離不同品種水蚤。
  （二）做水樣毒性試驗前，應先以參考毒物做確定試驗，以檢測水蚤之
        靈敏度，每一參考物至少須連續做10次確定試驗，以求取其平均
        LC50值及變異係數（Coefficient of Variation, CV）。生物試
        驗之CV值，一般不得超過50％。單一實驗室水蚤對氯化鎘及十二
        烷基硫酸鈉之LC50如附表。
  （三）如果對照組死亡率超過10％，則試驗結果不可採用，必須重做。
  （四）確定試驗水蚤之時齡不得超過24小時。
  （五）溶氧、水溫、pH、導電度等水質資料，在試驗期間不得有太大變
        化發生，以確保試驗結果之再現性。

十、精密度及準確度
    略

十一、參考資料
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    （四）U.S. Environmental Protection Agency. 1991. Methods fo
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          法─水蚤靜水式法驗證。EPA -83-5502-03-01。環保署環境檢
          驗所報告。
    （七）蔣燮治、堵南山。1979。中國動物誌，淡水枝角類，科學出版
          社，中國科學院中國動物志編輯委員會主編。
    （八）水野壽彥，1977，日本淡水圖鑑， Hoikusha 保育社。