一、方法概要
本方法係以濾膜過濾水樣，檢測水中大腸桿菌。水樣過濾後置於 m-T
EC培養基上，於35℃培養 2小時，再以44.5℃培養22小時，然後將濾
膜轉至含有尿素及酚紅之吸收墊上15分鐘，大腸桿菌會形成黃色、黃
綠色或黃棕色菌落。
|
二、適用範圍
本方法適用於地面水體、地下水體、飲用水（含自來水、簡易自來水
、社區自設公共給水設備水、連續供水固定設備水及其他直接供人飲
用之水等）、飲用水水質、娛樂用水、海水及放流水等水樣之大腸桿
菌群細菌之檢測。但不適於高濁度及含有干擾物質水樣之檢測。
|
三、干擾
（一）水樣中含有抑制或促進大腸桿菌生長之物質時，會影響水樣之檢
測結果。
（二）檢驗使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌生長之物質
時，會影響水樣之檢測結果。
（三）懸浮微粒過高或含有膠體的水樣易造成濾膜孔隙阻塞，影響水樣
檢驗結果之判讀。
（四）檢測使用之玻璃器皿及設備若遭受大腸桿菌污染時會影響檢測之
結果。
|
四、設備
（一）量筒：使用 100、500 及 1000mL 之量筒。
（二）吸管：使用 1、5 及 10mL 之滅菌玻璃吸管或無菌塑膠吸管，準
確度應達 0.1mL。
（三）稀釋瓶：使用 100、250 、500 及 1000mL 能耐高壓滅菌之硼矽
玻璃製品作為樣品之稀釋用。
（四）三角錐瓶：使用 250、500 、1000 及 2000mL 能耐高壓滅菌之
硼矽玻璃製品作為培養基及稀釋水之製作用。
（五）採樣容器：一般使用 100、250 及 500mL 無菌之玻璃或塑膠製
有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。
（六）培養皿：硼矽玻璃或可拋棄式塑膠製培養皿。其大小以 60 ×15
mm、50×12 mm 或其他適當大小者。
（七）過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌之玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材
質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置或重力固定於底部。
（八）抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在 138 至 207kPa 者
。
（九）濾膜：使用直徑 47mm 、孔徑 0.45 μm 且有格子記號的無菌濾
膜，能使水中大腸桿菌完全滯留者。
（十）吸收襯墊：不含亞硫酸根離子之圓形濾紙，直徑約為 48mm 並具
有足夠的厚度能吸收 1.8～2.2 mL培養液者。
（十一）鑷子：前端圓滑內側無波紋，使用前浸泡於 70 ％酒精再以火
燄燃燒滅菌。
（十二）水浴槽：溫度能維持在 50 ℃左右者。
（十三）培養箱：溫度能維持在 35 ±1 及 44.5 ±0.5 ℃者。
（十四）加熱板：可調溫度，並附磁石攪拌功能者。
（十五）紫外光滅菌燈：可作為細菌滅菌之用者。
（十六）菌落計數器：用於菌落數之計算，以暗視野且有放大裝置者為
佳。
（十七）天平：能精稱至 0.01 g 者。
（十八）高壓滅菌釜：用於稀釋瓶、過濾裝置等不能乾熱滅菌之材料及
用具之滅菌。能以中心溫度 121℃（壓力約 15 lb/in2 或 1
kg/cm2）滅菌15分鐘以上者。
（十九）烘箱：用於玻璃器皿等用具之乾熱滅菌，溫度能維持在 160℃
達 2小時或170℃達 1小時以上者。
|
五、試劑及材料
本方法所使用的化學葯品均為試葯級，培養基為微生物級製品。
（一）試劑
尿素－酚紅呈色劑
尿素 2.0g
酚紅 10 mg
試劑水 100mL
將上述三者混合後，調整 pH 值至 3至 4之間，儲存於冰箱中備
用，保存期限為一星期。
（二）培養基
1.m-TEC 培養基（m-TEC Agar)
3 號蛋白 5.0g
酵母抽出物 3.0g
乳糖 10.0g
氯化鈉 7.5g
磷酸氫二鉀 3.3g
磷酸二氫鉀 1.0g
硫酸月桂酸鈉 0.2g
去氧膽酸鈉 0.1g
Bromcresol purple 0.08 g
Bromcresol red 0.08 g
瓊脂 15.0g
依上述配方稱取各組成分或商業培養基 45.3g，加入 1 公升
的蒸餾水，以 121℃高溫高壓滅菌 15 分鐘。取出後置於50℃
左右之水浴槽待溫度下降至恒溫，培養基混搖均勻後分裝於直
徑 50mm 的培養皿中，每個培養皿約加入 4～6mL 的培養基，
凝固後避光保存於冰箱中備用，分裝後之培養基保存期限為14
天。可依檢測需要量按比例適量配製。
2.胰蛋白大豆瓊脂培養基
胰化蛋白 17 g
大豆蛋白 3 g
葡萄糖 2.5g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鈉 2.5 g
瓊脂 15.0g
按商業化培養基配方稱取定量之培養基粉末，加入一公升的蒸
餾水中，加熱溶解後，以 121℃以 121℃高溫高壓滅菌 15 分
鐘，滅菌後之 pH 值為 7.3±0.2 。培養基取出後置於 44 至
46℃之水浴槽待溫度下降至恒溫後混搖均勻，分裝於直徑50mm
的培養皿中，每個培養皿約加入 4～6mL 的培養基，凝固後避
光保存於冰箱中備用，分裝後之培養基保存期限為14天。可依
檢測需要量按比例適量配製。
（三）無菌稀釋液
1.無菌稀釋液一：地面水（海水除外）、地下水、飲用水及水源
水質檢測稀釋用。配製方法如下：
(1)磷酸二氫鉀溶液
取 3.4g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶於 50mL 的蒸餾水中，俟
完全溶解後，以 1.0 M NaOH 溶液調整其 pH 值為 7.2±0.
5 ，然後加蒸餾水至全量為 100mL，儲存於冰箱中作為儲存
液備用。
(2)氯化鎂溶液
取 8.1g 氯化鎂（MgCl2‧6H2O） 先溶於少量蒸餾水，俟完
全溶解後，再加蒸餾水至全量為 100mL，保存於冰箱中作為
儲存液備用。
分別取 10mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5mL 磷酸二氫鉀溶液，
再加入蒸餾水至全量為 2000mL ，混搖均勻後，分裝於稀釋
瓶中，經 121℃滅菌 15 分鐘，作為無菌稀釋液備用。保存
期限為一個月。
（四）無菌稀釋液二：海水或含鹽水樣稀釋用。
稱取磷酸二氫鈉 1.16g、磷酸氫化鈉 5.0g 及氯化鈉 17.0g，將
上述成分溶解於 2 公升的蒸餾水中，混搖均勻後，分裝於稀釋
瓶中，經 121℃滅菌 15 分鐘，作為無菌稀釋液備用。保存期限
為一個月。
|
六、採樣與保存
（一）採取微生物檢測之水樣時，應使用清潔並經滅菌之玻璃或塑膠容
器或市售無菌採樣袋。且於採樣時應避免受到污染。水樣若含有
餘氯時，無菌容器中應加入適量之硫代硫酸鈉（120 mL的水樣中
加入 0.1 mL 、10％的硫代硫酸鈉可還原 15mg/L 的餘氯）。
（二）水樣運送及保存之溫度應維持在 0～5 ℃並於採樣 24 小時內進
行檢測。
（三）水樣量以能做完所需檢測為度，但不得少於 200mL。
|
七、步驟
（一）水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上，以使樣品
充分混合均勻。
（二）水樣量之選擇取決於預期的大腸桿菌的密度。飲用水水樣以 100
mL全量過濾。其他樣品則視水樣中大腸桿菌可能濃度範圍進行水
樣稀釋步驟。使用無菌吸管吸取 10mL 之水樣至 90mL 之無菌稀
釋液中，形成 10 倍稀釋度之水樣，混搖均勻。而後自 10 倍稀
釋度水樣以相同操作方式進行一系列之 100、1000 倍等稀釋水
樣，並混搖均勻。進行上述稀釋步驟時，均需更換無菌吸管。水
樣稀釋步驟如附圖一所示。
（三）以無菌鑷子夾子夾起無菌濾膜，放在無菌過濾裝置之有孔平板上
，小心將漏斗固定。將過濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無菌稀
釋液，以測定過濾設備是否裝置妥當。
（四）檢驗飲用水或水源水質時，可過濾 100 mL 或更多的水樣體積。
其他水樣視大腸桿菌可能濃度範圍，以無菌吸管吸取 10mL 的原
液及（或）各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。過濾後，再以 2
0 至 30mL 之無菌稀釋液沖洗漏斗二至三次。每個稀釋度水樣均
需進行兩重複。
（五）沖洗過濾後，解開真空裝置，將漏斗移開，儘速以無菌鑷子取出
過濾後之濾膜置於培養基上。濾膜應與培基完全貼合，避免產生
氣泡。培養皿倒置於 35±1℃的恒溫培養箱中培養 2 小時，然
後再於44.5℃的培養箱或水浴槽中培養 22 小時。之後再將濾膜
轉至含有尿素及酚紅指示劑之吸收襯墊上 15 至 20 分鐘。
（六）過濾不同稀釋度水樣時，應更換無菌過濾器（漏斗）。亦可將過
濾器（漏斗）以火烤或紫外線滅菌 2 分鐘以上之後重複使用。
（七）計算並記錄各稀釋度培養皿中所產生的黃色或黃褐色菌落。若菌
落過多造成判讀困難，則以"大腸桿菌菌落太多無法計數"（E. c
oli Too numerous to count ; TNTC） 表示。
|
八、結果處理（計算實例請參照附表二）
（一）選取菌落數介於 20 至 60 間之同一稀釋度的兩個培養皿，計算
其菌落數，以菌落數（CFU）/100mL 表示之。計算公式如下：
所選取培養皿之黃色、黃綠
色或黃棕色菌落數
大腸桿菌菌落數（CFU/100mL）=────────────×10
0 所選取培養皿之實際水樣體
積總合
（二）培養皿之菌落數不在 20 至 60 個菌落之間時，則依菌落數實際
數目以下列方式處理：
1.若原液及各稀釋度水樣中僅有一個稀釋度的一個培養皿菌落數
在20 至 60 個之間，則以上述公式計算之。
2.若僅原液有菌落產生，且少於 20 個，應循上述公式計數菌落
數；若原液培養皿中均無菌落生長，則菌落數以小於 1 表示
。
3.若各培養皿之菌落數均不在 20 至 60 個之間，則選取最接近
60個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算。
（三）數據表示：若計算所得之菌落數小於 1，以 "＜1" 表示，菌落
數小於 100 時，以整數表示（小數位四捨五入），菌落數大於
100 以上時，取兩位有效數字，並以科學記號表示，例如菌落數
為142時以1.4×102表示之，菌落數為155時以1.6×102表示之，
菌落數為18900時以1.9×104 表示。
（四）報告必須註明採樣時間、開始培養時間、培養基名稱及各稀釋度
的原始數據。
|
九、品質管制
（一）微生物採樣及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
（二）進行微生物檢測時，所用的盛裝器具均應經滅菌處理。
（三）每次採樣時，應進行一組運送空白及野外空白。
（四）每批次或每十個水樣須進行一次試劑空白。
（五）每一批次的 m-TEC培養基均須以已知的大腸桿菌群、大腸桿菌及
非大腸桿菌群之菌株作測試，以確保數據品質。
（六）應記錄所有稀釋度水樣的原始數據，以備查核之用。
（七）每個稀釋度水樣至少須進行二重複。
（八）滅菌釜、恒溫箱、水浴槽及冰箱等設備應定期校正以確保數據品
質。
（九）不定期以胰蛋白大豆瓊脂培養基測試濾膜、稀釋水等是否為無菌
。
（十）本方法培養所得之細菌可能具有感染性，檢測後之培養基及器皿
應經高溫高壓滅菌始得以一般廢棄物理。
（十一）使用紫外光燈作滅菌時，操作人員應小心避免暴露於紫外線之
照射。
|
十、精密度及準確度
略
|
十一、參考文獻
（一）American Public Health Association, American Water Wor
ks Association & Water Pollution Control Federation.
Standard Methods for the Examination of Water and Wast
ewater, 20thed.1998
（二）Improver Enumeration Methods for the Recreactional Wat
eruality Indicators： Enterococci and Escherichia coli
USEPA Office of Science and Technology Washington DC
EPA/821/R-97/004 March 2000
|