1.適用範圍:本方法適用於食品中黴菌及酵母菌活菌數之檢驗。
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2.檢驗方法:
2.1 工作環境:工作平臺須寬敞、潔淨、光線良好,操作平臺光度約10
0 呎燭光;密閉室內換氣良好,儘可能沒有灰塵及流動空氣,每15
分鐘落菌數不得超過15 CFU/培養皿。
2.2 器具及材料:
2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器(Blender) 或鐵胃(Stomacher) :適用於無菌
操作。
2.2.4 冰箱:能維持 5±3℃。
2.2.5 水浴:能維持水溫溫差在±1 ℃。
2.2.6 培養箱。
2.2.7 天平:可稱量到2,000g以上,靈敏度為0.1g;可稱量到120g,
靈敏度為 1mg。
2.2.8 pH測定儀。
2.2.9 菌落計數器:適用於菌落之計算。
2.2.10 旋渦混合器(Vortex mixer)。
2.2.11 吸管輔助器(Pipette aid) 或微量分注器。
2.2.12 試管:16×150mm 試管或其他合適之附蓋試管。
2.2.13 吸管或吸管尖:已滅菌, 1mL吸管應有0.01mL之刻度; 5及
10mL吸管應有 0.1mL之刻度。
2.2.14 培養皿:已滅菌,內徑約90或 100mm,深度約15mm,底皿之
內外面應平坦,無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.2.15 稀釋用容器:有 450mL、99mL、90mL標記附蓋(栓)之廣口
瓶或無菌袋。
2.2.16 接種針及接種環(直徑約 3mm):鎳鉻合金,鉑銥或鉻線,
或無菌可拋棄式接種針(環)。
2.2.17 藥勺、剪刀、小刀、曲玻棒及鑷子:可滅菌。
2.2.18 無菌濾膜:孔徑 0.45 μm 之醋酸纖維濾膜。
2.2.19 試藥:乙醇( ethanol)、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鉀(
KH2PO4)、硫酸鎂(MgSO4.7H2O)、二氯喃(dichloran)
、孟加拉玫瑰紅( rose bengal)、甘油(glycerol)等均
採用試藥級。氯四環黴素(chlorotetracycline)、氯黴素
(chloramphenicol) 用檢定合格並標示力價者。洋菜(ag
ar)、蛋白 (peptone)、葡萄糖(glucose)、D-葡萄糖
(dextrose)、粉狀麥芽萃取物(malt extract, powdered
)採用微生物級。
2.2.20 稀釋液:
取蛋白 1g溶於蒸餾水1000mL,分裝於稀釋用容器中,以12
l℃滅菌15分鐘。
2.2.21 培養基:
2.2.21.1 二氯喃玫瑰紅氯黴素培養基(Dichloran rose bengal
chloramphenicol agar, DRBC)
葡萄糖(glucose) 10 g
蛋白 (peptone) 5 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1 g
硫酸鎂(MgSO4.7H2O) 0.5 g
5 %(w/v) 孟加拉玫瑰紅溶液(rose bengal) 0.5 mL
0.2 %(w/v) 二氯喃乙醇溶液(0.2% dichloran 1 mL
in ethanol)
洋菜(agar) 15 g
將上述成分溶於蒸餾水 990mL加熱溶解後,另稱取氯黴素
0.lg溶於蒸餾水10mL(註),合併混勻,以 121℃滅菌15
分鐘,最終pH值為5.6±0.2,待冷卻至45 ±1℃,取培養
基20~25mL注入培養皿中。本培養基組成份孟加拉玫瑰紅
具光敏感性,製妥後應置於冷暗處備用。
註:抗生素溶液(Antibiotic solutions)之配製與使用
A 氯黴素溶液:取氯黴素0.lg溶於蒸餾水10mL備用。
B 氯四環黴素溶液:取氯四環黴素0.5g溶於蒸餾水10
0mL ,以0.45μm 無菌濾膜過濾除菌後,置於能阻
光之無菌容器內,冷藏備用。有效期間為一個月,
使用時需回復至室溫並以無菌操作取用。
為抑制細菌生長,使用時,添加氯黴素溶液10mL至培
養基 990mL後,再滅菌,氯黴素的最終濃度為100mg/
L 。為更有效抑制檢體中細菌的生長,可添加氯黴素
溶液 5mL至培養基 985mL混合並滅菌,待培養基冷卻
至45±1 ℃時,加入經無菌濾膜除菌之氯四環黴素溶
液10mL,抗生素的最終濃度為 100mg/L。
2.2.21.2 二氯喃甘油培養基(Dichloran 18% glycerol agar, DG
18)
葡萄糖(glucose) 10 g
蛋白 (peptone) 5 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1 g
硫酸鎂(MgSO4.7H2O) 0.5 g
0.2 %(w/v) 二氯喃乙醇溶液(0.2% dichloran in
ethanol) 1 mL
洋菜(agar) 15 g
將上述成分溶於蒸餾水 800mL,加熱溶解後,再補充蒸餾
水使最後體積為 990mL,取氯黴素0.lg溶於蒸餾水10mL(
見2.2.21.1註),連同甘油220g合併混勻,以 121℃滅菌
15分鐘,最終pH值為5.6±0.2,水活性為0.95。當用於塗
抹平板培養法時,則滅菌後待冷卻至45±1 ℃,取培養基
20~25 mL 注入培養皿中,備用。用於傾注平板法時,則
滅菌後,待冷卻至45±1 ℃,備用。
2.2.21.3 馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato dextrose agar, PDA)
馬鈴薯浸出液(potato infusion) 200 g
D-葡萄糖(dextrose) 20 g
洋菜(agar) 20 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後,以 121℃滅菌15分鐘,最終pH值為5.6±0.2
,待冷卻至45±1 ℃,取培養基20~25 mL 注入培養皿中
,備用。
另於加熱溶解後,分取5~6mL至含螺旋蓋之試管,滅菌後
作成斜面。此培養基適用於菌株之保存,且應於使用前配
製。
馬鈴薯浸出液:取洗淨後不去皮馬鈴薯之切片約200g,置
蒸餾水1000mL中,煮沸30分鐘後以紗布過濾。
2.2.21.4 麥芽培養基(Malt agar, MA)
粉狀麥芽萃取物(malt extract, powdered) 20 g
洋菜(agar) 20 g
蒸餾水 1000 mL
加熱溶解後,以 121℃滅菌15分鐘,待冷卻至45 ±1℃,
取培養基20~25mL注入培養皿中,備用。另於加熱溶解後
,分取5~6mL至含螺旋蓋之試管,滅菌後作成斜面。
2.3 檢液之調製:
2.3.1 檢體之處理(註):
2.3.1.1 固態檢體:以無菌操作方式將檢體切碎,混合均勻後,取
50 g置入無菌袋,加入稀釋液 450mL,以鐵胃搓揉 2分鐘
,作成10倍稀釋檢液。或加入稀釋液1450mL,以經滅菌之
攪拌均質器攪拌30~60秒。
2.3.1.2 液態檢體:可用振搖的方式,充分混合均勻後,即為原液
,取50mL置入稀釋液 450mL中,作成10倍稀釋檢液。
2.3.1.3 凝態及濃稠液態檢體:如布丁、煉乳等,以無菌操作方式
將檢體適當混合後,取 50g加入稀釋液 450mL,以下步驟
同 2.3.1.1節之操作。
2.3.1.4 冷凍檢體:需解凍者,如冷凍魚(畜)肉、蔬果、水餃等
,宜置冷藏溫度下解凍(置於2~5℃,18小時以內)。俟
檢體解凍後,再以無菌操作方式予以適當切碎並混合均勻
。取 50g加入稀釋液 450mL,以下步驟同 2.3.1.1節之操
作。不需解凍者,如食用冰塊、冰棒、冰淇淋等製品,應
儘速以無菌操作方式將檢體分割成適當小塊。取 50g加入
稀釋液 450mL,以下步驟同 2.3.1.1節之操作。
註:1.檢體總量不足 50g(mL)時,依可採得之檢體量在
25~50 g(mL)的範圍內,添加適量之稀釋液作成
10倍稀釋檢液。
2.處理含油脂量多,不易勻散及易起泡沫之檢體時,
. 應加入適量之已滅菌乳化劑(如 1% Tween80),
充分振搖,使之乳化。
2.3.2 檢液之調製:分別使用無菌吸管,自10倍稀釋檢液依序作成一
系列適當之 100、 1,000、10,000倍等稀釋檢液,稀釋倍數視
需要而定。其稀釋方法如下圖所示。
2.4.1 塗抹平板法(Spread-plate method):
將各稀釋倍數之檢液及原液充分振搖均勻後,以無菌操作方式
分取 0.lmL注入一個已製備好之培養基平板上迅速以無菌之曲
玻棒塗將接源塗抹散佈,每一稀釋檢液需重複接種三皿。塗抹
平板法可採用DRBC培養基或DG18培養基,DRBC培養基因含二氯
喃、孟加拉玫瑰紅,能有效減緩生長快速黴菌之生長,而有利
其他酵母菌及黴菌之檢出,適用於塗佈型(spreader)黴菌(
如毛黴及根黴)之檢驗,故需同時計數酵母菌及黴菌時,應使
用DRBC培養基。當檢體水活性小於0.95時,DG18培養基更為適
用。
2.4.2 傾注平板法(Pour-plate method):
將各稀釋倍數之檢液及原液充分振搖均勻後,以無菌操作分取
lmL 注入一個培養皿,每一稀釋檢液重複做三皿,於每個培養
皿注入已冷卻至 45±1℃之DG18培養基20~25mL,溫和地以順
時針方向,續以反時針方向水平旋轉,在不沾染培養皿蓋之情
況下,混合稀釋檢液與培養基,從注入稀釋檢液至培養皿到加
入培養基應於1~2分鐘內完成,時間拉長將導致檢液中成分附
著於培養皿底部,而無法使檢液與培養基混合均勻。
2.4.3 採用塗抹平板法或傾注平板法時,自檢液調製至完成塗抹及傾
注步驟,應於20分鐘內完成。待培養基稍乾(塗抹平板)或凝
固(傾注平板)後,置於25℃暗處培養 5天,無菌落出現者需
繼續培養48小時,培養時勿倒置培養皿及重疊超過 3個以上,
培養期間不可移動以防孢子散落。
2.4.4 為品管計,應鑑定稀釋液及培養基是否污染,取兩個培養皿,
以稀釋液作檢液,採取上述相同之步驟製作一皿,另一皿不加
檢液僅以培養基作為空白試驗,並依 2.4.3節相同條件培養,
結果應不得檢出黴菌與酵母菌。
2.4.5 為鑑別菌種,可將分離出菌株培養在 PDA及MA培養基上。
2.5 計數:
2.5.1 選取含10~ 150個菌落之培養皿來計數。生長菌落以酵母菌者
為主,一個培養皿生長約 150個菌落尚屬可計數範圍;生長菌
落以黴菌為主者,則視種類而定,可計數範圍將較低;檢體含
菌量低,其菌落數在10個以下時,仍要計數。
2.5.2 當各稀釋倍數中僅有一種稀釋倍數檢液之培養皿菌落數為10~
150 個,則以該稀釋倍數之三個培養皿之菌落數平均值乘其稀
釋倍數,即得其菌落數,當兩種稀釋倍數檢液之培養皿菌落數
均為 10~150個時,則依下列公式計算之。
菌數(CFU/g 或 CFU/mL)
【(Aa+Ab+Ac)A+(Ba+Bb+Bc)B】÷2
= ─────── ───────
3 3
A、B:稀釋倍數。
Aa、Ab、Ac:A 稀釋倍數各培養皿內之菌落數。
Ba、Bb、Bc:B 稀釋倍數各培養皿內之菌落數。
2.5.3 菌數之表示:黴菌及酵母菌數之單位為 CFU/g或CFU/mL,菌落
數則取二位有效數字,應將菌落數平均值第三位數字四捨六入
(如 456以 460計),菌落數平均值第三位數字為 5,而第二
位數字為偶數,則捨去 5(如 145以 140計),第二位數字為
奇數,則進位(如 155以 160計)。各稀釋倍數均無菌落生長
者,則菌數應為小於 1乘以最低稀釋倍數,並註明該菌數為估
計值。
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