1.適用範圍：本檢驗方法適用於食品中仙人掌桿菌之檢驗。
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2.檢驗方法：
2.1 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好 (操作平台光度為 100
尺燭光) 、室內通風良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。微生物密度
之要求為每 15 分鐘落菌數不超過 15 個／培養皿 (內徑 85 ㎜) 。
2.2 器具及材料
2.2.1 乾熱滅菌器：玻璃器具等之滅菌用，其內部中心溫度能達 170 ℃
以上，並維持該溫度 1 小時以上者。
2.2.2 高壓滅菌釜：不能乾熱滅菌之材料 (培養基及稀釋液等) 及器具等
之滅菌用。滅菌溫度可達 121℃ (約 15 1b/in (2 次方) 或 1kg
/cm (2 次方) ，並能維持該溫度 15 分鐘以上。
2.2.3 冰箱：能保持 5 ± 3 ℃。
2.2.4 吸管：通常使用者為 10mL 及 1 mL ，應有 0.1 mL 及 0.01 mL
之刻度。
2.2.5 培養皿：內徑約 9 ㎝ ，深度 1.5～1.8 ㎝，底皿之內外面應平坦
，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.6 稀釋用容器：內容量為 100 mL 或 500 mL 之無菌袋或附蓋稀釋瓶
。
2.2.7 培養箱：能維持內部溫度溫差在 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.8 水浴：能維持水溫溫差在 ± 0.2℃ 以內者。
2.2.9 攪拌均質器 (Blender ) 或鐵胃 (Stomacher ) ：能適用於無菌操
作者。
2.2.10 接種用白金針或白金耳。
2.2.11 曲玻棒或塗抹棒。
2.2.12 試管：20×150 ㎜。
2.2.13 濾膜：具 0.45 μm 孔徑的無菌濾膜 (25㎜) 。
2.2.14 培養基。
2.2.14.1 甘露糖醇－蛋黃－多粘桿菌素洋菜培養基 (Mannitol-egg yo-
lk-polymyxin agar, MYP)
牛肉抽出物 (Beef extract) 1g
蛋白 (Peptone) 10g
D-甘露糖醇 (D-Mannitol) 10g
氯化鈉 (NaCl) 10g
酚紅 (Phenol red) 0.025g
洋菜 (Agar) 15g
蒸餾水 (Distilled water) 900mL
稱取各成分加熱溶解後，以 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，最後 pH
值為 7.2 ± 0.2 。冷卻至 50 ℃，加入 50mL 無菌之蛋黃液
(1 ) 及每 mL 含 1 萬單位的多粘桿菌素 B 硫酸鹽 (Pol-
ymyxin B sulfate) 溶液 10mL (2 ) 。培養基注入培養皿前
，應搖動混合，使絮狀沈澱物分散均勻，搖動時應避免產生氣
泡，每一培養皿約倒入 15 ～20 mL ，培養基表面使用前應保
持乾燥。
2.2.14.2 胰化酪蛋白－大豆－多粘桿菌素培養液 (Trypticase-soy-po-
lymyxin broth,TSPB)
基礎培養基：即為胰化酪蛋白大豆培養液 (Trypticase soy
broth, TSB)
胰化酪蛋白 (Trypticase peptone) 17g
大豆蛋白 (Phytone peptone) 3g
氯化鈉 (NaCl) 5g
磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 2.5g
葡萄糖 (Dextrose) 2.5g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，取 15mL 注入 20 × 150 ㎜ 試管中，以 121℃
滅菌 15 分鐘，最後 pH 值為 7.3 ± 0.2 ，冷卻後加入 0.1
mL 無菌之多粘桿菌素 B 硫酸鹽 (每 mL 含 1 萬 5 千單
位) (3 ) 。
2.2.14.3 營養洋菜培養基 (Nutrient agar, NA)
牛肉抽出物 (Beef extract) 3g
蛋白 (Peptone) 5g
洋菜 (Agar) 15g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，分裝於試管及三角瓶，以 121 ℃ 滅菌 15 分鐘
，最後 pH 值為 6.8 ± 0.2 。分裝於試管者，作成斜面培養
基；三角瓶者，分裝於培養皿，每一培養皿倒入 15～20mL ，
做成平面培養基，置於室溫下乾燥 1～2 天。
2.2.14.4 營養培養液 (Nutrient broth, NB)
牛肉抽出物 (Beef extract) 3g
蛋白 (Peptone) 5g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，分取 2.5 mL 注入試管內，以 121 ℃ 滅菌 15
分鐘，最後 pH 值為 6.8 ± 0.2 。
2.2.14.5 酚紅葡萄糖培養液 (Phenol red glucose broth)
蛋白 No.3 (Proteose peptone No.3) 10g
牛肉抽出物 (Beef extract) 1g
葡萄糖 (Dextrose) 5g
酚紅 (Phenol red) 0.018g
氯化鈉 (NaCl) 5g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，分取 3 mL 注入試管內，以 118 ℃ 滅菌 10 分
鐘，最後 pH 值為 7.4 ± 0.2 。
2.2.14.6 硝酸鹽培養液 (Nitrate broth)
牛肉抽出物 (Beef extract) 3g
蛋白 (Peptone) 5g
硝酸鉀 (KNO3) (無亞硝酸鹽者) 1g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，分取 3 mL 注入試管內，以 121 ℃ 滅菌 15 分
鐘，最後 pH 值為 7.0 ± 0.2 。
2.2.14.7 酪胺酸洋菜培養基 (Tyrosine agar ) ：取已滅菌 2.2.14.3
節營養洋菜培養基 100 mL ，冷卻至 50 ℃，加入經 121 ℃
滅菌 15 分鐘之 10 mL 5 ％ 酪胺酸溶液，一面混合均勻，一
面無菌分取 3.5 mL 注入已滅菌之試管，並迅速冷卻做成斜面
，以避免酪胺酸之析出。
2.2.14.8 溶菌 培養液 (Lysozyme broth) ：取已滅菌 2.2.14.3 節 9
9mL 營養洋菜培養基，冷卻後加入 1 mL 0.1 ％溶菌 溶液 (
此溶液需經濾膜過濾) ，再分裝 2.5 mL 至已滅菌之試管。
2.2.14.9 歐普氏培養基 (Voges-Proskauer medium)
蛋白 (Proteose peptone) 7g
氯化鈉 (NaCl) 5g
葡萄糖 (Dextrose) 5g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
溶解後，分取 5 mL 注入試管內，以 121 ℃ 滅菌 10 分鐘，
最後 pH 值為 6.5 ± 0.2 。
2.2.14.10 胰化酪蛋白－大豆－羊血洋菜培養基 (Trypticase soy sheep
blood agar)
基礎培養基：胰化酪蛋白大豆洋菜培養基 (Trypticase soy a
-gar,TSA)
胰化酪蛋白 (Trypticase peptone) 15g
大豆蛋白 (Phytone peptone) 5g
氯化鈉 (NaCl) 5g
洋菜 (Agar) 15g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，以 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，冷卻至 50 ℃，加 5
0mL 去纖維蛋白之羊血 (Defibrinated sheep blood) 搖動混
合均勻，倒入培養皿。
2.2.14.11 運動性試驗培養基 (Motility test medium)
胰化酪蛋白 (Trypticase) 10g
酵母抽出物 (Yeast extract) 2.5g
葡萄糖 (Dextrose) 5g
磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) 2.5g
洋菜 (Agar) 3g
蒸餾水 (Distilled water) 1000mL
加熱溶解後，分取 2 mL 注入試管中，以 121 ℃ 滅菌 15 分
鐘，最後 pH 值為 7.4 ± 0.2 ，製備好後，於室溫放置 2
天後再使用。
2.2.15 試藥：氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、結晶紫 (Crystal vio-
let ) 、草酸銨、多粘桿菌素 B 硫酸鹽、碘化鉀、碘、沙黃 O
(Safranin O) 、30 ％ 過氧化氫、醋酸、α－ 酚 (α-Naph-
thol) 、氫氧化鉀、肌酸、乙醇、甲醇、液態石蠟或礦物油、對
－胺基苯磺酸 (Sulfanilic acid ) 、鋅粉、亞甲藍 (Methyle-
neblue) 、氯化汞、鹼性復紅 (Basic fuchsin ) 、TB 石碳酸
復紅 ZN (TB carbolfuchsin ZN ) 等均採用化學試藥級，蛋白
採用微生物級。
2.2.16 稀釋液 (4 )
2.2.16.1 生理食鹽水：取 8.5g 氯化鈉溶於 1000mL 蒸餾水中，分裝於
稀釋用容器，以 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，最後 pH 值為 7.0±
0.1 。
2.2.16.2 磷酸鹽緩衝溶液：取 34 g 磷酸二氫鉀溶於 500 mL 蒸餾水，
俟完全溶解後，以 1N 氫氧化鈉溶液調節其 pH 值為 7.2，然
後加蒸餾水至全量為 1000mL ，以 121 ℃ 滅菌 15 分鐘後，
貯存於冰箱中，作為原液備用。使用時，取 1.25mL 原液加蒸
餾水至全量為 1000mL ，分裝於稀釋用容器中，以 121 ℃ 滅
菌 15 分鐘，最後 pH 值為 7.2±0.1 。
2.2.16.3 蛋白 稀釋液：取 1g 蛋白 溶於蒸餾水中至全量為 1000mL
，分裝於稀釋用容器中，以 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，最後 pH
值為 7.0±0.1 。
2.2.17 革蘭氏染色液 (Gram's stain solution)
2.2.17.1 哈克氏 (Hucker's) 結晶紫液 (初染劑)
溶液Ａ：取 2g 結晶紫溶於 20mL 之 95 ％乙醇中。
溶液Ｂ：取 0.8g 草酸銨溶於 80mL 蒸餾水中。
將溶液Ａ與溶液Ｂ混合，靜置 24 小時後以濾紙過濾，取濾液
作為初染劑。
2.2.17.2 革蘭氏碘液 (媒染劑) ：取 2g 碘化鉀及 1g 碘置於研缽中，
經研磨 5～10 秒鐘後，加 1 mL 蒸餾水研磨，次加 5 mL 蒸
餾水研磨，再加 10mL 蒸餾水，研磨至碘化鉀和碘完全溶於水
中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研缽及杵後
，以此洗液併入，使溶液達 300 mL 。
2.2.17.3 哈克氏 (Hucker's) 複染液 (複染劑) ：取 2.5g 沙黃 O 溶
於 100 mL 之 95 ％乙醇中，供作複染原液。使用時，取 10
mL 原液加 90 mL 蒸餾水，作為複染液。
2.2.18 亞甲藍染色液 (Methylene blue staining solution)
溶液Ａ：取亞甲藍 0.3 g 溶於 30mL 之 95 ％ 乙醇中。
溶液Ｂ：取 0.01 g 氫氧化鉀溶於 100 mL 蒸餾水中。
混合溶液Ａ與溶液Ｂ。
2.2.19 鹼性復紅染色液 (Basic fuchsin staining solution ) ：取 0
.5g 鹼性復紅溶於 20mL 之 95 ％乙醇中，再以蒸餾水稀釋至 1
00mL (若染劑未完全溶解，以濾紙過濾) 。
2.2.20 試劑
2.2.20.1 歐普氏試劑 (Voges-Proskauer reagent, VP reagent)
溶液Ａ：取 5g α－ 酚溶於 100 mL 之無水乙醇中。
溶液Ｂ：取 40 g 氫氧化鉀溶於蒸餾水中，使成 100 mL 。
2.2.20.2 亞硝酸鹽試劑 (Nitrite reagent) ：
溶液Ａ：取對－胺基苯磺酸 1g 溶於 125mL 5N 醋酸中。
溶液Ｂ：取α－ 酚 1g 溶於 200mL 5N 醋酸中。
2.2.20.3 碘試劑 (Iodine reagent)
取 1g 碘化鉀溶於 5 mL 蒸餾水，再加 0.5g 碘，完全溶解後
，加蒸餾水使成 100 mL 。
2.3 檢液之調製
2.3.1 檢體之處理 (5 ) (6 )
2.3.1.1 固體檢體先適當切碎，混合均勻後，取 50 g 加入 450 mL 已滅
之稀釋液中，用攪拌均質器攪拌，初以低速攪拌數秒鐘，然後高
速，攪拌的總時間不能超過 2 分鐘或以鐵胃搓揉 2 分鐘，即
為 10 倍稀釋檢液。
2.3.1.2 粉狀、粒狀或其他易於粉碎的檢體，可用已滅菌之藥勺或其他方
便使用的用具加以粉碎，並混合均勻，取 50 g 加入 450 mL 已
滅菌之稀釋液，即為 10 倍稀釋檢液。
2.3.1.3 液態檢體搖勻後，取 50mL 加 450 mL 已滅菌之稀釋液，即為 1
0 倍稀釋檢液。
2.3.1.4 冷凍檢體須解凍者，如冷凍魚 (畜) 肉、冷凍水產加工品、蔬果
、水餃等，應在冷藏之溫度下解凍 (如 2～5 ℃，18 小時內即
可解凍完全) ；亦可使用更高的溫度快速解凍 (即放在 45 ℃以
下的水浴中，可於 15 分鐘內解凍之檢體適用之) ，解凍時應經
常搖動檢體，以幫助檢體的解凍。俟檢體解凍後，再予以適當切
碎並混合均勻。取 50 g 加入 450 mL 已滅菌之稀釋液中，用攪
拌均質器攪拌 (攪拌方法同 2.3.1.1節) ，即為 10 倍稀釋檢液
。不須解凍者，如食用冰塊、冰棒、冰淇淋等冰類製品，應先儘
速使成適當小塊。取 50 g 加入 450 mL 已滅菌之稀釋液中，用
攪拌均質器攪拌 (攪拌方法同 2.3.1.1節) ，即為 10 倍稀釋檢
液。
2.3.1.5 凝態及濃稠液態檢體如布丁、煉乳等，經適當攪拌均勻後，取 5
0 g 加入 450 mL 已滅菌之稀釋液中，用攪拌均質器攪拌 (攪拌
方法同 2.3.1.1節) ，即為 10 倍稀釋檢液。
2.3.2 檢液之處理：分別使用滅菌之吸管，以 10 倍稀釋檢液依序作成一
系列適當之 100 倍，1,000 倍，10,000 倍等稀釋檢液，其稀釋
方法如下圖所示。
2.4 鑑別試驗
2.4.1 分離培養：將 2.3 節之稀釋檢液及 (或) 原液充分搖動，混合均
勻後，分別吸取 0.1 mL 置入已裝有 MYP 培養基上，每一稀釋檢
液至少做二重複，以曲玻棒均勻塗抹培養基表面，靜置乾後，倒置
於 30℃ 培養箱中培養 24～48 小時，觀察所形成菌落之生長狀態
，若有需要時，應再行純化。仙人掌桿菌在 MYP 培養基上典型的
菌落為菌落中間部份通常為白色，邊緣為半透明、菌落周圍有濃厚
沈澱之環帶 (表示有卵磷脂分解 之活性) ，背景有明顯之粉紅色
者為可疑仙人掌桿菌。選取含 15～150 個可疑仙人掌桿菌菌落之
MYP 培養皿予以計數，其菌數之表示方式為 CFU/g 或 CFU/mL 。
由前述培養皿各鉤取 3～5 個可疑菌落，分別接種於 NA 斜面及 N
B ，置於 30℃ 培養箱中培養 24 小時。
2.4.2 仙人掌桿菌數之計算
計算仙人掌桿菌數時，所選取的數個可疑菌落，經 2.4.4 節及 2
.4.5 節試驗確定為仙人掌桿菌者，再依確定之比例估算。若各稀
釋倍數中僅有一種稀釋倍數培養皿之菌落數為 15～150 個，則應
以該稀釋倍數之兩個培養皿之平均菌落數乘其稀釋倍數及確定的比
例，即得其仙人掌桿菌數；但若有兩稀釋倍數之培養皿之菌落數在
15 ～150 個之間時，則應依下列公式計算出平均菌落數再乘上稀
釋倍數及確定為仙人掌桿菌之比例，但記錄仙人掌桿菌數時應將該
數字第三位數字四捨五入，使其有效數為兩位。
Aa+Ab ＹA Ba+Bb ＹB
(───)‧Ａ‧──＋(───)‧Ｂ‧──
2 ＸA 2 ＸB
仙人掌桿菌數 (CFU ＝───────────────────
/g 或 CFU/mL ) 2
Ａ、Ｂ：稀釋倍數 (如從 10 倍稀釋檢液吸取 0.1 mL ，其稀釋倍
數＝10×10＝100 倍；而從 100 倍稀釋檢液吸取 0.1 m
L ，其稀釋倍數＝10×100 ＝ 1000 倍) 。
Aa、Ab：含Ａ稀釋倍數各培養皿內之可疑仙人掌桿菌菌落數。
Ba、Bb：含Ｂ稀釋倍數各培養皿內之可疑仙人掌桿菌菌落數。
ＸA、ＸB：由Ａ及Ｂ稀釋倍數各培養皿所鉤取之可疑菌落數。
ＹA、ＹB：由Ａ及Ｂ稀釋倍數各培養皿所鉤取之可疑菌落數，經 2
.4.4 節及 2.4.5 節試驗確定為仙人掌桿菌之菌落數
。
2.4.3 最確數 (Most Probable Number, MPN)
2.4.3.1 當檢體中仙人掌桿菌數低於 100 CFU/g 或 10 CFU/mL 時，採用
此法。
2.4.3.2 分別吸取 2.3.2 節之 10 ，100 ，1,000 倍等稀釋檢液或原液
1mL ，接種於裝有 TSPB 之試管中，每檢液各接種 3 支，置於
30 ℃ 培養箱中培養 48±2 小時，若呈混濁狀，劃線培養於 M
YP 培養基，再依 2.4.1，2.4.4 及 2.4.5 節確定，並依最確
數表 (如附表) 推算仙人掌桿菌之最確數。
2.4.4 鏡檢 (Microscopic examination )
2.4.4.1 自 NA 斜面上鉤取可疑菌落，作革蘭氏染色 (7 ) 後鏡檢，其結
果若為革蘭氏陽性，菌體形成長或短鏈狀，芽胞為橢圓形，位於
中央或微偏離中央位置，芽胞具薄壁，且不使菌體膨脹；若作亞
甲藍染色 (8 ) 後鏡檢，其結果為芽胞有明顯之深藍色者，則應
進行生化試驗。
2.4.5 生化試驗
2.4.5.1 觸 試驗 (Catalase test ) ：自 NA 斜面上鉤菌，塗抹於載玻
片上，加 1～2 滴 3 ％ 過氧化氫溶液，觀察有無氣泡產生，若
產生氣泡者為正反應，否則為負反應。仙人掌桿菌為正反應。
2.4.5.2 厭氧下葡萄糖之利用 (Anaerobic utilization of glucose) ：
自 NA 斜面上鉤菌，接種於酚紅葡萄糖培養液中，直接置入厭氧
缸內或者再徐徐加入已滅菌之液態石蠟或礦物油至高度約 2.5㎝
後，置於 35℃ 培養箱中，培養 24 小時。若培養液由紅色變成
黃色者，為正反應，否則為負反應。仙人掌桿菌為正反應。在未
接菌的對照組試管中，會因為培養基暴露在厭氧缸產生的 CO2
中，而造成 pH 的下降，以致可能發生紅色變成橙色／黃色之局
部顏色變化的現象。所以應使用合適的正反應和負反應對照組，
以區別正反應和偽正反應。
2.4.5.3 硝酸鹽還原試驗 (Reduction of nitrate) ：自 NA 斜面上鉤菌
，接種於硝酸鹽培養液中，置於 35℃ 培養箱中，培養 24 小時
後，各加入亞硝酸鹽試驗試劑Ａ及Ｂ 0.5～1mL ，輕輕搖勻後觀
察結果：若在 10 分鐘內呈橘紅色為正反應；若顏色無變化時，
加入少許鋅粉而有橘紅色呈現時，則為負反應，否則亦為正反應
。仙人掌桿菌為正反應。
2.4.5.4 歐普氏試驗 (VP test ) ：自 NA 斜面上鉤菌，接種於歐普氏培
養基中，置於 35℃ 培養箱中培養 48 ± 2 小時後，取 1mL
培養液至另一已滅菌之試管中，加歐普氏試劑之溶液Ａ 0.6 mL
及歐普氏試劑之溶液Ｂ 0.2 mL 後，再加入少許肌酸，輕輕搖勻
，經 1 小時後觀察結果，若呈現粉紅色則為正反應，否則為負
反應。仙人掌桿菌為正反應。
2.4.5.5 β－溶血性試驗 (β－hemolysis test) ：用油性簽字筆在胰化
酪蛋白－大豆－羊血洋菜培養皿底劃分成 6 至 8 等分區域，
每區可接種一株菌，各區標識清楚後，自 NA 斜面上鉤菌，劃線
於各區上，置於 35℃ 培養箱中，培養 24 小時。若菌落生長的
周圍有明顯透明環，則為正反應；否則為負反應。仙人掌桿菌為
正反應。
2.4.5.6 酪胺酸分解試驗 (Tyrosine decomposition test ) ：自 NA 斜
面上鉤菌，接種於酪胺酸洋菜斜面培養基上，置於 35℃ 培養箱
中，培養 48 小時。若培養基斜面靠近菌落生長的部分呈透明者
，表示酪胺酸已被分解，為正反應；否則為負反應，應再觀察 5
天。仙人掌桿菌為正反應。
2.4.5.7 溶菌 耐性試驗 (Lysozyme-resistant test ) ：自 NA 斜面上
鉤菌，接種於溶菌 培養液及營養培養液 (後者為對照組) ，置
於 35℃ 培養箱中培養 24 小時。若二者之培養液均呈混濁狀態
，則為正反應；否則為負反應，應再置於 35℃ 培養箱中培養 2
4 小時後觀察。仙人掌桿菌為正反應。
2.4.5.8 運動性試驗 (Motility test ) ：自 NA 斜面上鉤菌，穿刺接種
於運動性試驗培養基中，深度約 3 ㎜ ，置於 30℃ 培養箱中，
培養 18～24 小時，若沿穿刺線呈放射狀生長，為正反應，否則
為負反應。大部分之仙人掌桿菌為正反應，部分仙人掌桿菌為負
反應。
2.4.5.9 蛋白質毒素晶體試驗 (Protein toxin crystal test) ：菌體接
種於 NA 斜面，置於 30℃ 培養箱中培養 24 小時後，再置於室
溫 2～3 天，在載玻片上滴一滴無菌水，鉤取菌體製成薄抹片，
風乾，通過火焰輕微加熱固定，冷卻後浸入甲醇中 30 秒，取出
傾掉載玻片上甲醇，風乾後，再浸入 TB 石碳酸復紅 ZN 或 0.5
％鹼性復紅染液，並以微火溫和加熱染液至蒸氣出現，移走火焰
，俟 1～2 分鐘後，再重複此步驟一次，取出，放置 30 秒，再
以自來水沖洗，經自然乾燥，於油鏡下觀察是否產生游離芽孢及
暗黑色的四角形或鑽石狀之毒素晶體，毒素晶體經常比游離芽孢
稍小。仙人掌桿菌可產生游離芽孢，不產生毒素晶體。
2.4.5.10 根狀生長試驗 (Rhizoid growth test ) ：自 NB 取一白金耳
量之菌液，接種於 NA 平面培養基 (應盡量接種於培養基之正
中央) ，俟表面乾燥後，置於 30℃ 培養箱中，培養 24～72
小時。若菌落呈現毛髮狀或根狀，且由接種處延伸數公分，則
為根狀生長。仙人掌桿菌不呈根狀生長。
2.5 判定
2.5.1 仙人掌桿菌陽性者，應符合下表所列之結果。
┌────────┬────────┬───────┬────┐
│試 驗│ 正 反 應 │ 負 反 應 │仙人掌桿│
│ │ (＋) │ (－) │菌之反應│
├────────┼────────┼───────┼────┤
│鏡檢1.革蘭氏染色│深紫色。菌體形成│淡紅色 │＋ (a) │
│ │長或短鏈狀、芽胞│ │ │
│ │橢圓形。中央或微│ │ │
│ │偏離中央位置，芽│ │ │
│ │胞具薄壁，且不使│ │ │
│ │菌體膨脹。 │ │ │
│ 2.亞基藍染色│芽胞呈明顯之藍色│芽胞無明顯藍色│ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│觸 試驗 │有氣泡產生 │無氣泡產生 │ ＋ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│厭氧下葡萄糖利用│黃色 │原色 │ ＋ │
│試驗 │ │ │ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│硝酸鹽還原試驗 │橘紅色 │原色 (b) │ ＋ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│歐普氏試驗 │粉紅色 │原色 │ ＋ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│溶血性試驗 │透明環 │無透明環 │ ＋ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│酪胺酸分解試驗 │透明 │不呈透明 │ ＋ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│溶菌 耐性試驗 │混濁 │澄清 │ ＋ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│運動性試驗 │沿穿刺線呈放射狀│沿穿刺線無放射│ ± │
│ │生長 │狀生長 │ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│蛋白質毒素晶體試│產生四角形或鑽石│不產生毒素晶體│ – │
│驗 │狀之毒素晶體 │ │ │
├────────┼────────┼───────┼────┤
│根狀生長試驗 │菌落呈毛髮狀或根│菌落不呈毛髮狀│ – │
│ │狀 │或根狀 │ │
└────────┴────────┴───────┴────┘
(a ) 「＋」表示 90 ％以上為正反應。
(b ) 若無橘紅色產生時加入少許鋅粉，而有橘紅色呈現則為負反應，否
則亦為正反應。
(c ) 50～90 ％菌株為正反應。
2.5.2 仙人掌桿菌菌數：
由 2.5.1 節判定為仙人掌桿菌陽性者，依 2.4.2 節計算其仙人
掌桿菌數。
註 (1)：蛋黃液之配製：雞蛋洗淨，浸入 0.1 ％ 氯化汞溶液 1 小時，
再浸入 70 ％乙醇溶液中 30 分鐘，取出蛋黃加入等量之無菌生
理食鹽水。
(2)：每 mL 含 1 萬單位多黏桿菌素Ｂ硫酸鹽溶液之配製：取 50 萬
單位之多黏桿菌素Ｂ硫酸鹽，溶於 50mL 蒸餾水後，再以具有 0
.45 μm 孔徑濾膜之微孔濾器作無菌過濾。
(3)：每 mL 含 1 萬 5 千單位多黏桿菌素Ｂ硫酸鹽溶液之配製：取
50 萬單位之多黏桿菌素Ｂ硫酸鹽，溶於 33.3mL 蒸餾水後，再
以具有 0.45 μm 孔徑濾膜之微孔濾器作無菌過濾。
(4)：除肉製品使用蛋白 稀釋液外，其他檢體通常使用之稀釋液為磷
酸緩衝溶液，其次為生理食鹽水。
(5)：檢體之處理應使用無菌操作技術。
(6)：處理含油脂量多，不易勻散及易起泡之檢體時，應加入適量滅過
菌的乳化劑 (如 Triton X-100, Tergitol Anionic 7 或 1 ％
Tween 80 等 ) ，並充分搖動，使之乳化。
(7)：革蘭氏染色方法：
(1) 製成薄抹片，採自然風乾，勿用火烤。
(2) 初染：將已固定之抹片，用哈克氏 (Hucker's) 結晶紫液染 1
分鐘後，水洗，應不超過 5 秒鐘。
(3) 媒染：加革蘭氏碘液作用 1 分鐘後，水洗。
(4) 脫色：用 95 ％乙醇洗至不再有紫色褪出時，再以自來水沖洗
。此步驟需時甚短，僅數秒鐘即可，惟視抹片之厚薄而定。
(5) 複染：用哈克氏 (Hucker's) 複染液複染 30 秒鐘，水洗。
(6) 自然風乾。
(7) 鏡檢：呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏
陰性菌。
(8)：亞甲藍染色方法：將已固定之抹片用亞甲藍染色液染色 1分鐘後
，水洗，自然風乾並鏡檢。
附表：最確數表
┌────────────┬─────┬───────┐
│正 反 應 試 管 數 │ │ 95 ％信賴界限│
├───┬───┬────┤MPN/mL (g)├───┬───┤
│0.1mL │0.01mL│0.001mL │ │下 限│上 限│
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 0 │ 0 │ 0 │ 0.00 │ 0.00 │ 9.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 0 │ 0 │ 1 │ 3.01 │ 0.15 │ 9.6 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 0 │ 1 │ 0 │ 3.05 │ 0.15 │ 10.7 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 0 │ 1 │ 1 │ 6.11 │ 1.24 │ 18.1 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 0 │ 2 │ 0 │ 6.19 │ 1.24 │ 18.1 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 0 │ 3 │ 0 │ 9.44 │ 3.56 │ 37.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 0 │ 0 │ 3.57 │ 0.17 │ 18.1 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 0 │ 1 │ 7.23 │ 1.26 │ 18.2 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 0 │ 2 │ 11.0 │ 3.56 │ 37.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 1 │ 0 │ 7.36 │ 1.26 │ 20.3 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 1 │ 1 │ 11.2 │ 3.56 │ 38.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 2 │ 0 │ 11.4 │ 3.56 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 2 │ 1 │ 15.4 │ 4.50 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 1 │ 3 │ 0 │ 15.7 │ 4.52 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 0 │ 0 │ 9.18 │ 1.44 │ 37.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 0 │ 1 │ 14.3 │ 3.62 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 0 │ 2 │ 19.9 │ 4.52 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 1 │ 0 │ 14.7 │ 3.68 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 1 │ 1 │ 20.5 │ 4.52 │ 42.0 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 1 │ 2 │ 26.8 │ 8.70 │ 94.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 2 │ 0 │ 21.1 │ 4.52 │ 42.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 2 │ 1 │ 27.6 │ 8.70 │ 94.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 2 │ 2 │ 34.8 │ 8.70 │ 94.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 3 │ 0 │ 28.6 │ 8.70 │ 94.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 2 │ 3 │ 1 │ 36.0 │ 8.70 │ 94.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 0 │ 0 │ 23.1 │ 4.58 │ 94.5 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 0 │ 1 │ 38.5 │ 8.70 │ 105 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 0 │ 2 │ 63.6 │ 16.8 │ 183 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 1 │ 0 │ 42.7 │ 9.00 │ 183 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 1 │ 1 │ 74.9 │ 16.9 │ 200 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 1 │ 2 │ 115 │ 37.0 │ 425 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 1 │ 3 │ 159 │ 40.0 │ 425 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 2 │ 0 │ 93.3 │ 18.1 │ 425 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 2 │ 1 │ 149 │ 37.0 │ 425 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 2 │ 2 │ 215 │ 40.0 │ 427 │
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 2 │ 3 │ 292 │ 90.0 │ 1,000│
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 3 │ 0 │ 240 │ 42.0 │ 1,000│
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 3 │ 1 │ 462 │ 90.0 │ 2,000│
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 3 │ 2 │ 1,100 │ 180 │ 4,100│
├───┼───┼────┼─────┼───┼───┤
│ 3 │ 3 │ 3 │ - │ 425 │ - │
└───┴───┴────┴─────┴───┴───┘
說明：(1) 若稀釋倍數為 10 、100 、100 倍，由 TSPB 劃線於 MYP 上
而經判定仙人掌桿菌陽性，且 TSPB 呈現混濁，經培養基並進
行生化試驗，確認含有之試管數為 3-1-0 ，對照 MPN 數應
為 42.7 ，即該檢體仙人掌桿 MPN 數為 43/mL (g ) 。
(2) 若稀釋倍數為原液、10、100 倍，由 TSPB 劃線於 MYP 上而
經判定仙人掌桿菌陽性，且 TSPB 呈現混濁，經培養基並進行
生化試驗，確認含有之試管數為 3-1-0 ，則該檢體仙人掌桿
菌 MPN 數為 42.7÷10＝4.27≒4.3/mL (g ) 。
(3) 若稀釋倍數為 10 、1000、10000 倍時，而結果同上，則該檢
體仙人掌桿菌 MPN 數為 42.7×10＝427≒4.3×10 (2次方 )
/mL(g)，其餘類推。
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3.參考文獻
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