1 適用範圍：本檢驗方法適用於禽畜肉及其製品中殘留沙利黴素之檢驗。
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2 檢驗方法：
2.1 工作環境：工作平台須寬敞，潔淨，光線良好(操作平台光度為 100
呎燭光) ，室內通風良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。微生物密度
之要求為每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU/ 培養皿 (內徑 85 mm)
。
2.2 器具及材料：
2.2.1 不銹鋼圓筒：規格為外徑 8 ± 0.1 mm ，內徑 6 ± 0.1 mm，高1
0 ± 0.1 mm。
2.2.2 生物分析盤 (Nunc bioassay plate)：規格為長 24.3 cm，寬 24.
3 cm，厚 1.8cm。
2.2.3 薄層層析板 (Thin layer chromatography plate)：規格為長 20
cm，寬 20cm ，厚 250μm 矽膠層析板或同級品。
2.2.4 展開槽 (Developing chamber) ：玻璃製品槽底需平坦，供 TLC
板展開用。
2.2.5 高壓滅菌釜 (Autoclave)：能 121℃ 15 lb/in2 滅菌 15 分鐘以
上者。
2.2.6 微量吸管 (Micropipette)：規格為 20μL、100 μL 及 200μL。
2.2.7 離心管 (Centrifuge tube) ：玻璃或塑膠製品，容量為 50 mL 。
2.2.8 離心機 (Centrifuger)：轉速可至 4,000 rpm 者。
2.2.9 培養皿：內徑約 9 cm ，深度 1.5-1.8cm，底皿之內外應平坦，無
氣泡、刮傷或其它缺點。
2.2.10 恒溫培養箱：箱內溫度可控制在 36 ±1℃ 者。
2.2.11 攪拌均質器 (Blender) 或鐵胃 (Stomacher)：能適用於無菌操
作者。
2.2.12 冰箱：能維持 5 ± 3℃ 者。
2.2.13 吸管：通常使用者為 10mL 及 1mL，應有 0.1 mL 之刻度。
2.2.14 乾熱滅菌器：玻璃用具等之滅菌用，其內部中心溫度能達 170℃
以上，並維持該溫度 1 小時以上者。
2.2.15 減壓濃縮裝置 (Rotary evaporator)。
2.2.16 測徑用游標尺 (Vernier calipers) 。
2.3 試藥：甲醇、2-丙醇、環己烷、四氯化碳等均採化學試藥級，沙利黴
素鈉鹽標準品。
2.4 試驗菌：Bacillus subtilis ATCC 6633 芽孢懸浮液 (108 CFU/mL )
。
2.5 培養基：
抗生素培養基 1 號 (Antibiotic medium No.1) 之配製
蛋白 (Peptone) 6.0 g
胰消化乾酪素 (Pancreatic digest of casein) 4.0 g
酵母抽出物 (Yeast extract) 3.0 g
牛肉抽出物 (Beef extract) 1.5 g
葡萄糖 (Dextrose) 1.0 g
洋菜 (Agar) 15.0 g
蒸餾水 1000 mL
稱取以上成份加熱溶解，121℃ 滅菌 15 分鐘，最後 pH 值為 6.5±
0.1。滅菌後待冷卻至約 50℃，以 0.1％之比例加入 B.subtilis 芽
孢懸浮液，培養皿每只分裝 20mL ，生物分析盤則每只分裝 200 mL
，於平坦檯面自然凝固備用
2.6 展開液：
環己烷：2-丙醇 (150：50, V/V)
2.7 標準溶液之配製：
稱取適量之沙利黴素標準品於定量瓶中，以甲醇配製成 1000 μg/mL
，當作原液 (應於 5℃下冷藏，15 日內使用) 。取適量之原液置於
定量瓶中，以無菌蒸餾水稀釋成.1.0, 2.0, 4.0,8.0 及16.0 μg/mL
等五種不同濃度，其中 4.0 μg/mL 訂為參比濃度 (Reference con-
centration)。
2.8 標準曲線之製作：
2.8.1 將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於已配製好之培養基上，按 600 圓心
角放置 6 個圓筒。
2.8.2 每一濃度沙利黴素之標準溶液均取三個培養皿為一組，於每個培養
基上放置之 6 個圓筒相間之 3 個圓筒內注入標準溶液，其餘 3
個圓筒注入參比濃度標準液。注入量為 280μL 。四種標準溶液 (
參比濃度除外) 共需 12 個配製好之平板培養基。
2.8.3 於 36±1℃之恆溫箱中培養 17± 1 小時後，以抗生素抑菌圈測讀
計或游標尺測量抑菌圈直徑之大小。
2.8.4 量取同一濃度標準溶液之 9 個抑菌圈直徑及 9 個參比濃度之抑
菌圈直徑，分別計算平均值。
2.8.5 求取參比濃度 36 個抑菌圈直徑，計算其平均值，並以此作為該抗
生素標準曲線之修正點 (Correction point) 。
2.8.6 以修正點和該抗生素參比濃度抑菌圈直徑平均值之差，調整各標準
溶液抑菌圈直徑平均值，每一標準溶液因此可得一修正抑菌圈直徑
平均值 (如當修正點為 20.0 mm，參比濃度抑菌圈平均值為 19.8m
m ，二者之差為 0.2mm，樣品抑菌圈平均值若為 17.0 mm，則需修
正為 17.2 mm) 。
2.8.7 在半對數函數紙上，以四種濃度之標準溶液修正抑菌圈直徑平均值
及修正點為橫軸 (自然數值) ，濃度為縱軸 (對數值) ，繪出標準
曲線。
2.8.8 該標準曲線最低濃度抗生直徑平均值 (L) 及最高濃度抗生直徑平
均值
(H)可由下列公式算出：
L＝(3a＋2b＋c－e)/5
H＝(3e＋2d＋c－a)/5
a,b,d,e 為低至高濃度標準溶液之修正抑菌圈直徑平均值，c 為修
正點。
2.9 檢液之調製：
2.9.1 稱取 10 克之檢體加甲醇 20mL ，振盪萃取 15 分鐘，以 2,200
rpm 離心 10 分鐘，取上層液。
2.9.2 上層液加 20mL 四氯化碳，振搖 5 分鐘，以 2,200rpm 離心 10
分鐘，取下層液。重覆此步驟 2 次，並合併下層液。
2.9.3 下層液於 60℃ 水浴下以減壓濃縮至乾 (或氮氣吹乾) 。
2.9.4 殘渣以甲醇定容至 2 mL ，作為檢液，供作圓筒平板法或生物自析
鑑別法之用。
2.10 圓筒平板法(cylinder plate method)：
2.10.1 將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於培養基上，按 60° 圓心角放置 6
個圓筒。
2.10.2 取上述培養皿 3 個，使用微量吸管吸取檢液 280 μm，分別注
入於每個培養皿之 3 個間隔圓筒內，另外 3 個圓筒內則分別
注入參比濃度標準溶液各 280 μL。
2.10.3 於 36 ± 1℃之恆溫箱中培養 17± 1 小時後，測量樣品檢液與
抗生素參比濃度溶液之抑菌圈直徑。
2.10.4 若檢液無明顯抑菌圈 (直徑小於9 mm) 表示無沙利黴素之殘留，
若有明顯抑制圈 (直徑 9mm 以上) 時，則繼續進行生物自析鑑
別法。
2.11. 生物自析鑑別法 (bioautography)：
2.11.1 於薄層層析板下端基線 3 公分處，分別設定檢液及沙利黴素標
準液之原點，點間距離為 2 公分。
2.11.2 於設定之原點上，以微量吸管分別注入檢液及沙利黴素標準溶液
各 30 μL 於薄層層析板。
2.11.3 將薄層層析板放入展開槽中，以展開液展至原點上方 15 公分處
，取出風乾至少 30 分鐘後，於 80℃ 烘箱乾燥 2 小時，冷卻
備用。
2.11.4 將上述之薄層層析板密貼於裝有含 B.subtilis 孢子懸浮液抗生
素培養基 1 號之生物分析盤，排除接觸面之氣泡，加皿蓋置於
室溫下靜置至少 12 分鐘，移去薄層層析板。
2.11.5 將上述之生物分析盤移入 36±1 ℃ 之恆溫箱中培養 17 ±1 小
時。
2.11.6 以一透明膠紙放在生物分析盤表面將各原點及抑菌點之位置及範
圍用油性簽字筆描繪出。
2.11.7 以游標尺量標準品及樣品抑菌點中心到原點之高度以求出 Rf 值
(Rf 值之計算為：抑菌點中心至原點之距離／展開液從原點展
開之距離) 。當樣品抑菌點之 Rf 值和沙利黴素標準品之 Rf 值
相同時，即可確認為有沙利黴素之殘留。
2.12 回收率試驗：
分別添加 100 μg/mL 沙利黴素標準溶液 20,40,80,160 及 320μ
L 於 10 克檢體中，使添加濃度分別為 0.2, 0.4, 0.8, 1.6 及 3
.2 μg/g，做三重複試驗。依 2.9. 步驟調製檢液。再以 2.10.
步驟分別測量其抑菌圈直徑。並以下列公式計算，求得樣品之回收
率。各添加濃度之樣品回收率＝A / B × 100%
A：各添加濃度之檢液所產生之抑菌圈直徑平均值。
B：5倍於添加濃度之標準溶液所產生之抑菌圈直徑平均值。
樣品平均回收率為 5 添加濃度樣品回收率之平均值。
2.13 沙利黴素殘留量之估算：
以沙利黴素標準溶液之修正點和參比濃度抑菌圈平均值之差，修正
樣品抑菌圈平均值，以樣品之修正抑菌圈平均值由標準曲線求得樣
品殘留沙利黴素濃度。並以下列公式計算，求得該樣品之沙利黴素
實際殘留量。
樣品沙利黴素殘留量 (ppm) ＝S / R
S：標準曲線上求得之樣品殘留沙利黴素濃度 (ppm) 。
R：該類空白樣品添加沙利黴素試驗平均回收率 (％)。
備註：本試驗方法之最低檢出含量為1μg/mL
參考文獻：
1 經濟部中央標準局。1983。飼料添加物檢驗法－抗生素之微生物學測定
通則。中國國家標準總號 902 ，類號 N4098。
2 經濟部中央標準局。1988。肉及肉製品中殘留四環素類抗生素檢驗法，
中國國家標準總號 12322，類號 N6209。
3 經濟部中央標準局。1988。食品中動物用藥殘留量檢驗方法－孟寧素驗
。中國國家標準總號 13630，類號 N6281。
4 日本厚生省生活衛生局乳肉衛生課。1990。畜水產食品中殘留物質檢查
法。
5 AOAC international.,1998. Official Method of Analysis, 16th ed
., sec 957.23. AOAC international, Gaithersburg, MD.
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Count, in DA Bacteriological Analytical Manual. 8th ed. pp.3.0
1-3.10. Food and Drug Administration.
7 Vanderkop,P.A. and Macneil, J.D.1990. Separation and detection
of monensin, lasalocid and salinomycin by thin-layer chromato-
graphy/bioautography. Journal of Chromatography 508,pp.386-390
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