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法規名稱: 新城病檢驗方法
時間: 中華民國092年09月09日

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壹、前言
    新城病 (Newcastle disease ,以下簡稱 ND)  是由副粘液病毒科 (
    Paramyxoviridae)  的 Avulavirus 屬新城病病毒 (Newcastle dis-
    ease virus,以下簡稱 NDV) 所引起。禽類副粘液病毒 (paramyxov-
    irus,以下簡稱 PMV) 在血清學的分類可分為 PMV-1 (paramyxovir-
    us type 1)  至 PMV-9 (paramyxovirus type 9) 等 9  個血清型;
    ND  病毒為 PMV-1  型。本病自 1926 年首次發現以來,已廣佈於全
    球大部份國家,因此世界各地雞隻大都需以疫苗來進行防疫。NDV 依
    其對雞感染的病原性高低和臨床症狀分為 5  個病原型包括:(1) 強
    毒內臟型:具有高病原性,常見胃腸出血病變,(2) 強毒神經型:呈
    現高度死亡率,通常有呼吸及神經症狀,(3) 中間毒型:呈現呼吸症
    狀,偶有神經症狀,但具低死亡率,(4) 弱毒型或呼吸道型:呈現輕
    微或無臨床症狀的呼吸道感染及 (5)  無症狀腸道型:沒有臨床症狀
    的腸道感染型。本病不易區別其病原型,即使病毒感染無特定病原 (
    SPF)  雞也會出現前述重疊的病狀,其中弱毒株感染時會因其他病原
    重複感染或環境情況不良而加劇本病臨床症狀,且病毒感染不同宿主
    也有不同的反應,使得 ND 在臨床診斷上頗為困難,因此若單靠臨床
    症狀來診斷本病常無法得到正確的診斷結果。
    我國對新城病的定義是大腦內接種致病性指數 (intracerebral pat-
    hogenicity index,以下簡稱 ICPI)  在 0.7  以上或融合蛋白 (F 
    protein)  氨基酸序列第 113  至 116  個位置具有 3  個以上鹼性
    氨基酸且第 117  個位置為苯丙氨酸 (phenylalanine)。

貳、臨床症狀
一、一般症狀
    臨床症狀的嚴重程度因病毒株及感染鳥類的年齡、免疫狀況、種別等
    因素而異,由幾乎無明顯的呼吸症狀到非常嚴重的沈鬱、產蛋量下降
    、呼吸頻率增加、大量下痢後死亡或存活者出現神經症狀。嚴重病型
    之死亡率可達 100%。潛伏期常為 5  至 6  天,亦可能為 2  至 1
    5 天。
二、強毒內臟型
    病程甚短,臨床上一發病就開始死亡,病雞出現食慾廢絕,體溫上升
    至 42 至 43 ℃。病雞會出現精神沉鬱、嗜眠、逆毛及排出帶有白色
    的濃綠色下痢便,聚集在角落不動。眼、喉及臉部常見水腫,並由喉
    頭發出囉音及奇音或開口呼吸,無法起立及抽搐,一般經 1  至 3  
    日病程後就死亡。病程較長者開始出現斜頸、歪頭及腳麻痺。急性型
    之死亡率在 90 %至 100%。
三、強毒神經型
    主要症狀為沉鬱、呼吸症狀、下綠色便及神經症狀等。產蛋降低或停
    止,肉垂及肉冠呈暗紫色,中雞以下的症狀較嚴重。病程經過較為慢
    性,成雞死亡率約 5%,小雞死亡率為 50 至 80 %。
四、中間毒型
    輕微的呼吸症狀及下痢,產蛋下降或停止。其死亡率低。
五、弱毒型
    主要造成中等程度或不顯性的呼吸道感染,其死亡率極低。
六、無症狀腸道型
    無臨床症狀或無病理學上變化。

參、病理變化
一、肉眼病理變化
 (一) 強毒內臟型病變
      主要的病變在消化道 (腺胃及腸管) 的出血、潰瘍及壞死等病變。
      腺胃出血病變易出現於食道或腺胃移行部,有時全面性出血;腸管
      淋巴組織易出現出血、潰瘍及壞死等病灶;脾臟有時會出現白色壞
      死點;出現呼吸症狀之病例可見氣管粘膜增厚、充出血及滲出液增
      加。結膜充出血及眼瞼與顏面腫賬;卵巢異常;共泄腔充出血;華
      氏囊肥厚、水腫及充出血。心冠狀溝點狀出血。
 (二) 強毒神經型病變
      主要的病變在呼吸道,包括氣管粘液增加、粘膜增厚、氣囊輕度混
      濁、增生增厚及肺炎之病變。
二、組織病理變化
 (一) 全身各淋巴組織如脾、胸腺、華氏囊、盲腸扁桃、消化道及呼吸道
      之粘膜固有層、腦之血管周圍的淋巴球會崩壞及消失,並有巨噬細
      胞之增生。脾、胸腺及消化道的病灶伴有纖維素滲出。氣管上皮細
      胞增生。
 (二) 急性病例的中樞神經系統可見血管周圍性淋巴細胞的增殖、神經細
      胞的壞死及小神經膠細胞反應。病程較長者血管周圍的浸潤細胞由
      漿細胞轉為淋巴球,大腦、中腦、視葉、延腦及小腦出現壞死灶。

肆、實驗室檢驗
一、病毒檢驗
 (一) 採取病材
      1 由新鮮死雞或瀕死雞之臟器分離病毒較佳。因此,由病死雞中採
        取口、鼻拭子及肺、腎、腸 (包括腸內容物) 、脾、腦、肝及心
        臟等組織臟器。所採取之組織臟器可以分開或混合,但腸管則通
        常分開放置。
      2 活雞採樣包括氣管及共泄腔拭子,共泄腔拭子一定要包含有糞便
        。小型脆弱的禽類可能受限於拭子太大而不容易採取,則以收集
        排出之新鮮糞便代之。
      3 採取的試材應放m在磷酸鹽緩衝溶液 (phosphate buffered sal-
        ine ,以下簡稱PBS) 內,pH 7.0  至 7.4, 含抗生素。所加抗
        生素可因地置宜,如組織及氣管拭子添加 penicillin (2,000 u
        /ml) 、streptomycin (2 mg/ml) 或 gentamicin (50 μg/ml) 
        ,前述糞便及共泄腔拭子試材則須提高抗生素濃度 5  倍以上。
        添加抗生素後必須調整 pH 值為 7.0  至 7.4。糞便及組織研製
        成 10 至 20 % (w/v)  乳劑。乳劑在室溫放置 1  至 2  小時
        後應馬上進行試驗,如存放在 4℃不可超過 4  天。
 (二) 病毒分離
      1 糞便或組織乳劑經由 1,000 g  轉速離心 10 分鐘,溫度不超過
        25℃,所得上清液經 0.45 μm 過濾膜濾過後之濾液接種於 9
        至 11 日齡 SPF  雞胚尿囊腔內,每個雞胚各接種 0.2 ml 。接
        種後在 35 ℃至 37 ℃恒溫箱中靜置觀察 4  至 7  天。
      2 將死胚蛋與未死亡胚蛋放置在 4℃,待 10 小時以上降溫後抽取
        尿囊液,同時取少量尿囊液與 5%雞紅血球懸浮液進行平板血球
        凝集試驗或 1%雞紅血球懸浮液進行試管血球凝集試驗 (hemag-
        glutination test,以下簡稱 HA),以檢測血球凝集素 (hemag-
        glutinin) 活性之有無,若呈陰性反應則應再盲目繼代增殖 2次
        。
 (三) 病原鑑定
      血球凝集試驗中,A 型流行性感冒病毒或其他 8  種血清型副粘液
      病毒或含有血球凝素的細菌等亦會產生血球凝集現象,因此,均會
      影響判定。此時可以使用特異新城病抗血清進行血球凝集抑制試驗
       (hemagglutination inhibition test,以下簡稱 HI)  來同定。
 (四) 病原性鑑定
      由於新城病病毒毒力強弱之不同及活毒疫苗廣泛地被使用,所以由
      出現臨床症狀的病雞所分離之新城病病毒,必須再進一步進行鑑定
      ,方法如下:
      1 雞胚平均死亡時間 (mean death time in eggs ,以下簡稱 MDT
        )
      (1) 抽取新鮮 ND 病毒液以滅菌生理鹽水連續 10 倍稀釋成 10-6
          至 10-9,每一稀釋倍數濃度分別接種 0.1ml  至 5  個 9至
          10  日齡 SPF  雞胚尿囊腔,然後放置在 37 ℃孵卵器中。
      (2) 每一稀釋倍數接種後剩餘的病毒存放在 4℃,8 小時後再各接
          5 個雞胚蛋,同樣置 37 ℃中。每日 2  次照蛋檢查,連續 7
          日,記錄雞胚死亡時間。造成接種雞胚全部死亡的最高稀釋倍
          數即為最小致死劑量 (the minimum lethal dose) ,MDT  即
          為最小致死劑量殺死胚胎的平均時間。
      (3) MDT 小於 60 小時為強毒株,60  至 90 小時為中間毒株,大
          於 90 小時為弱毒株。
      2 大腦內接種致病性指數 (ICPI)
      (1) 抽取新鮮 ND 病毒液 (HA  力價須高於 16 倍者) 以滅菌生理
          鹽水稀釋 10 倍,取該稀釋液 0.05 ml  分別大腦內接種於 1
          0 隻 1  日齡 SPF  小雞,接種後每 24 小時觀察一次,連續
          觀察 8  日並記錄之。
      (2) 正常雞之記錄值為 0,病雞為 1,死亡雞為 2,ICPI  即為全
          部 8  日內每日每隻雞的平均數值,所以 ICPI 值 1.5  以上
          則為強毒型新城病,而弱毒株的值則接近 0。
      3 靜脈內接種致病性指數 (intravenous pathogenicity index ,
        以下簡稱 IVPI)  抽取新鮮 ND 病毒液 (HA  力價高於 16 倍) 
        以滅菌生理鹽水 10倍 稀釋,取該稀釋液 0.1 ml 分別靜脈內接
        種於 10 隻 6  週齡 SPF  雞,接種後 10 日內每日觀察雞死亡
         (記錄值為 3.0) 、麻痺 (記錄值為 2.0) 和發病 (記錄值為 1
        .0) 情形,並計算其毒性平均數值,弱毒株和一些中間毒株之 I
        VPI 值近似 0,而強毒株的 IVPI 值約為 3.0。
      4 單源抗體
        以小鼠 (Balb/C) 研製成的抗 ND 病毒單源抗體 (monoclonal
        antibodies,以下簡稱 Mabs)  可藉由 HI 方法快速鑑定不同血
        清型別的禽類副黏液病毒,此項技術可去除免於多價 (pol clo-
        ne) 抗 ND 病毒血清與其他禽類副黏液病毒的交叉反應的問題。
        由於 Mabs 在 HI 時對不同 ND 病毒株具有特異性,因此若有多
        種 Mabs,可基於他們各自是否和某種病毒發生特異性反應的情 
        形來建立 ND 病毒的分類及鑑別,尤其可應用快速鑑別是否為 N
        D 強毒株。
二、血清學檢測:
    可利用 HI 、中和試驗或酵素連結免疫吸附法 (enzyme-linked imm-
    unosorbent assay,以下簡稱 ELISA) 等血清學試驗診斷新城病。目
    前,HI  最常被廣泛使用。一般雞群血清在進行血清學試驗時很少有
    非特異陽性反應發生,所以不需任何前處理,但其他品種的家禽血清
    有時會與雞紅血球發生非特異性凝集現象,因此,在進行血清學試驗
    時必須利用雞紅血球先行吸附以去除其他非特異性因子,方能獲得正
    確的血清試驗值。加有抗凝血劑之雞新鮮血液,必須以 PBS  溶液洗
    三次,然後懸浮製備成 1%RBC 溶液。每次試驗時應同時放入陽性和
    陰性對照血清。
 (一) 血球凝集試驗
      1 PBS 溶液分裝至 96 孔塑膠微量孔盤中每一孔,每孔 0.025 ml 
        。
      2 每行第一孔放置 0.025 ml 病毒懸浮液 (如感染的尿囊液) 。
      3 進行 0.025 ml 病毒液 2  倍連續稀釋。
      4 每孔再加 0.025 ml PBS 溶液。
      5 最後每孔加入 0.025 ml 的 1%雞 RBC  溶液 (v/v)。
      6 輕輕振盪混合,室溫 (25℃) 中靜置 40 分鐘,或 4℃、60分鐘
        ,直到紅血球沉降至底部。
      7 將盤子傾斜觀察紅血球淚滴狀流下之有無,以決定血球凝集現象
        。病毒力價之計算係以判讀血球完全凝集孔中 (不產生淚滴狀流
        下現象) 最高稀釋倍數即成為 1  單位血球凝集力價 (hemaggl-
        utination unit,以下簡稱 HAU) ,所以該稀釋力價倍數的倒數
        為受檢測病毒懸浮液的血球凝集力價。
 (二) 血球凝集抑制試驗
      1 取 PBS  溶液分裝至 96 孔塑膠微量孔測定盤中,每一孔 0.025
        ml。
      2 加入 0.025 ml 血清至測定盤中每行的第一孔。
      3 自第一孔起,取 0.025 ml 量進行 2  倍連續稀釋。
      4 每孔加 4 HAU  的病毒抗原 0.025 ml 並輕輕混合後,靜置於室
        溫中 30 分鐘或 4℃靜置 60 分鐘。
      5 加 0.025 ml 1 %雞 RBC  懸浮液至每一孔並輕輕混合後,靜置
        室溫中約 40 分鐘或 4℃靜置 60 分鐘,對照之 RBC  懸浮液應
        完全沉降至底部。
      6 HI  力價判定:形成 4 HAU  抗原完全抑制之最高血清稀釋倍數
        即為 HI 力價。
      7 陰性對照血清的力價 HI 不應大於 1/4,陽性對照血清 HI 力價
        應和已知力價相同,否則應重做或修正之。
      國際標準 ND 抗血清可自國際畜疫會 (OIE)  參考實驗室取得冷凍
      乾燥的雞抗血清或實驗室自製標準血清。許多商品化的新城病 EL-
      ISA 套組也可使用,用於檢測新城病病毒抗體之
      ELISA 套組依其原理分為直接法、三明治法及阻斷法或競爭法等。
三、病毒核酸序列分析
 (一) 病毒 RNA  萃取
      有兩種方法,第一種為利用以商品化之 RNA  萃取套組,其操作步
      驟請按廠商所附步驟進行。第二種方法為利用有機溶劑萃取,其方
      法簡述如下:
      病毒尿囊液和病材之臟器組織作成 10 倍乳劑。取 100μl 病材乳
      劑加入 1 ml 核酸萃取液 (Trizol solution)  充份混合 30 秒並
      靜置室溫 5  分鐘,加入 200 μl  氯仿 (chloroform) 以手動上
      下倒置混合 15 秒後靜置室溫 3  分鐘,置於 4℃下 12,000 g 離
      心 15 分鐘。取上清液與等量 isopropanol  充分混合靜置室溫 1
      0 分鐘,再置於 4℃下 12,000 g 離心 15 分鐘。倒棄上清液加入
      1 ml 75 %乙醇後於 4℃下 14,000 g 離心 5  分鐘後去上清液。
      置 56 ℃烘箱或真空乾燥去除水份後加入 60 至 80μl  含 DEPC 
       (diethylpyrocarbonate) 處理過的無菌水溶解,迅即進行 RT-PC
       R 過程。
 (二) 反轉錄聚合鏈反應(RT-PCR)操作過程
      參考現有文獻,列出二組 F  基因之特異性引子供參考,第一組之
      參考文獻為:Avian Diseases (1999)43:125-130;第二組之參考
      文獻為:J. Clin. Microbiol. (1995)33: 2624-2630。
      而二組引子之序列與 RT-PCR 條件如下:
      第一組:
      F47 (+):ATG GGC (T/C)C(T/C) A(A/G)A (T/C)CT TCT AC
      F580(-):CTG CCA CTG CTA GTT G(G/T)G ATA ATC C
      增幅產物大小:534 bp
      反轉錄聚合  鏈反應條件
      1 反轉錄作用:單一循環:42℃,60分鐘
      2 聚合  鏈反應:三十五個循環,94℃ 30 秒,51℃ 30 秒,72℃
        1 分鐘。單一循環,72℃ 7  分鐘。
      第二組:
      F1: 5'-CCTTGGTGA(C/T)TCTATCCG(C/T)AG-3'
      F2: 5'-CTGCCACTGCTAGTTG(T/G)GATAATCC-3'
      增幅產物大小:254 bp
      反轉錄聚合  鏈反應條件:
      1 反轉錄作用:單一循環,42℃ 60 分鐘。
      2 聚合  鏈反應:三十五個循環,94℃ 30 秒,50℃ 30 秒,72℃
        1 分鐘。單一循環,72℃ 7  分鐘。
 (三) 核酸序列分析
      將步驟五 (二) 合成之 PCR  產物進行自動核酸序列分析,分析融
      合蛋白氨基酸序列,第 113 - 116 個位置若具有 3  個以上鹼性 
      氨基酸且第 117  個位置為苯丙氨酸 (phenylalanine)  即判定為
      新城病。
 (四) 注意事項
      抽取待測病材乳劑之核酸時,必須同時作已知陽性病材乳劑及已知
      陰性病材乳劑之核酸抽取,再一起作 RT-PCR 反應。所得結果必需
      為已知陽性病材有預期 RT-PCR 產物,而且陰性病材沒有,在此前
      提下待測病材所得之結果才具可靠性。

伍、參考文獻:
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