一、方法概要：
本方法以多管發酵方式檢驗水中好氧、革蘭氏染色陰性之鐵細菌（Le
ptot hrix spp.），該屬細菌為絲狀，菌體外有菌鞘，生長於有機養
分較低的環境中，其最適生長溫度為25至30℃，在含有鐵、錳離子的
環境中生長時，於菌鞘上會聚集黃褐色或黑褐色之氫氧化鐵或氧化錳
沈澱。
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二、適用範圍：
本方法適用於檢驗流動緩慢，未受污染且含有鐵離子淡水中的絲狀鐵
細菌，但不適用於含有干擾物質（如：毒性物質等）的水樣。
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三、干擾：
（一）水樣中含有抑制或促進絲狀鐵細菌生長之物質，如餘氯或維生素
等。
（二）檢驗使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進絲狀鐵細菌生長之物
質。
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四、設備：
本方法中使用的各種器皿均應經滅菌處理：
（一）採樣容器：無菌的硼矽玻璃或塑膠容器，亦可使用無菌袋。
（二）稀釋瓶：能耐高溫高壓滅菌之有蓋硼矽玻璃或塑膠製品，但不可
以使用棉花塞當蓋子，一般有100mL刻度者。
（三）量筒：一般使用10mL、25mL、50mL及100mL的量筒。
（四）吸管：一般使用1mL、5mL及10mL之玻璃或無菌塑膠製品，應有0.
1mL之刻度。
（五）三角錐度：硼矽玻璃製品， 100mL、250mL、500mL或1000mL，可
作為混合培養基的容器，且方便儲存者。
（六）試管：大小約150×15㎜之試管或有蓋螺旋試管。
（七）培養箱：溫度能保持在30±1℃者。
（八）高壓滅菌釜：用於稀釋液、培養基及不能乾熱滅菌之材料、實驗
用具的滅菌。能以121℃（約151b/in2或1㎏/㎝2）滅菌15分鐘以
上者。
（九）乾熱滅菌器：用於玻璃器皿之滅菌。溫度能保持在160℃、2小時
或170℃、1小時以上者。
（十）顯微鏡：一般光學顯微鏡，具有10、40、100倍接物鏡者。
（十一）pH計。
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五、試劑：
（一）培養基：
Leptothrix2xPYG 培養基
每一升 Leptothrix 2x PYG 培養基含有下列成分：
蛋白（Peptone） 0.5g
酵母抽出物（Yeast extract） 0.5g
葡萄糖（Glucose） 0.5g
硫酸鎂（MgSO4．7H2O） 0.6g
氯化鈣（CaCl2．2H2O） 0.07g
N-[2Hydroxyethyl]piperazine-N-[2-ethane sulfonicacid 3.5
7g]（HEPES)
硫酸錳（Manganese sulfatemono-hydrate） 17.0mg
蒸餾水（Distilled water ） 400mL 1.0L
將 pH 值調至 7.3，再經 121 ℃ ， 15 分鐘滅菌
（二）稀釋液：
1.磷酸二氫鉀溶液：
取 3.4g 磷酸二氫鉀溶於 50mL 之蒸餾水中，俟完全溶解後，
以 1.0N 氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為7.2 ± 0.5。然後加蒸
餾水至全量為 100 mL ，儲存於冰箱中作為原液備用。
2.氯化鎂溶液：
取 8.1g 氯化鎂（MgCl2‧6H2O ），先溶於少量蒸餾水中，俟
完全溶解後，然後加蒸餾水至全量為 100 mL ，儲存於冰箱中
作為原液備用。
使用時分別取 1.25mL 磷酸二氫鉀溶液及 5.0 mL 氯化鎂溶液
混合，再加蒸餾水至全量為 1,000 mL ，混搖均勻後，分裝於
稀釋瓶中，經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘以上，做為稀釋液備用。
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六、採樣與保存：
（一）採樣：
1.採樣時，必須使用清潔並經滅菌之容器或無菌袋，及溫度能維
持在0至5℃之樣品儲存設備。
2.水樣如果有餘氯時，在採樣時應加入適量硫代硫酸鈉溶液（如
在120mL的水樣中加入0.1mL10％的硫代硫酸鈉，可還原15㎎/L
的餘氯）。
3.所採取之樣品應具有代表性，且在檢驗之前不再被污染。
（二）保存：
1.水樣運送及保存之溫度應維持在0至5℃。
2.樣品自採樣後至進行檢驗，其保存時間不得超過24小時。
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七、步驟：
（一）水樣取回後，先進行水樣稀釋步驟，分別使用滅菌過之吸管依序
做成一系列適當之10倍、100倍、1,000倍、10,000倍等稀釋水樣
，並混搖均勻。進行每一稀釋步驟時，應取10毫升水樣（或稀釋
水樣）至90毫升無菌稀釋水中，其稀釋方法如圖一所示。
（二）取1mL適當稀釋水之水樣接種於一連中含9 mL Leptothrix 2xPYG
培養基的試管中，做三連續稀釋度各五重複（若水樣量太少則做
三重複），測試最大可能數（Most Probable Number;MPN）。
（三）在35±1℃ 下靜置培養，觀察有無絲狀菌體形成，並取樣以顯微
鏡觀察，若有帶鞘狀之絲狀細菌的存在，則為陽性。
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八、結果處理：
（一）如果檢測時的稀釋度超過連續三次，應採用其中最具意義的三種
稀釋度。以表一為例。
（二）由上述方法所得結果應以「最大可數（ MPN）」計算及記錄，以
三種連續稀釋度各做五重複的 MPN可自表二中查出，表中附有95
％可信賴極限。
（三）表二中所示之水樣量為10mL、1mL及0.1mL，若相當於換算以後之
水樣為1.0mL、0.1mL及0.01mL時，應將由表中對應查出數字乘10
倍：若用0.1mL、0.01mL及0.001mL時，則應乘 100倍，其餘依此
類推。
（四）100mL水中絲狀鐵細菌最大可能數（MPN）之計算公式如下：
查表所得之 MPN 值
100mL 水中絲狀鐵細菌最大可能數＝─────────
（MPN/100mL） 最具意義之三種稀釋
倍數之中間水樣體積
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九、品質管制：如果樣品中懸浮顆粒過多而造成吸管堵塞時，必須先將樣
品用攪拌器（Blender） 攪拌。如經攪拌仍無法解決堵塞的問題時，
則可改用廣口吸管（Large tip opening pipoet）。
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十、精密度及準確度：
（一）多管發酵法之結果在統計上的可靠性比濾膜法低，但可用多次水
樣檢驗以提高其準確度。例如每 1mL水中含有一個絲狀鐵細菌時
，依據逢機分析的理論：若以1mL的水樣做檢驗，有 37％的機率
為陰性反應，但是以重複五支試管做檢驗，全部試管均為陰性反
應的機率低於1％。
（二）以五重複之試管，10mL、1mL、0.1mL之三連續稀釋度所得陽性反
應試管數組管，其對應之MPN指數，其 95％可信賴極限如表二中
所列。
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十一、參考資料：
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