一、方法概要
水樣經玻璃纖維濾紙過濾後，於 90 ％丙酮中以組織研磨器研磨萃取
其中之葉綠素 a，再以藍光光源的螢光儀測得螢光值，最後依螢光值
計算水樣中葉綠素 a含量。
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二、適用範圍
本方法適用於地面水體、飲用水水源水質及海域地面水體等水中所含
葉綠素 a之檢測。本方法之偵測極限估值為 0.11 μg/L 。
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三、干擾
（一）萃取物如產生紅色光區的螢光會干擾葉綠素 a 的量測。
（二）樣品中其他葉綠素或胡蘿蔔素濃度過高會有螢光熄滅效應，應將
樣本作稀釋以克服之。
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四、設備及材料
（一）量筒：使用 100、500 或 1000mL 之量筒。
（二）玻璃纖維濾紙：直徑為 47mm 或 25mm ，孔徑約 0.7 μm（What
man GF/F 或同等級產品）。
（三）過濾裝置：薄膜過濾裝置。
（四）真空抽氣裝置：水壓式、吸氣式或手動式，壓力差低於 0.2kg/c
m2（=20 kPa） 者。
（五）鑷子。
（六）錫箔紙。
（七）存放盒：能遮光，在運送過程及儲存時，可以存放含過濾樣本之
濾紙者。
（八）運送儲存器：運送過程不超過 4 小時，用維持在 0-4℃的儲存
器如旅行冰箱內加放冰塊；若超過 4 小時，則需存放在低於 -
20℃的儲存器內如液態氮桶、乾冰桶或冰箱之冷凍櫃。
（九）冷凍櫃 ：可長期維持在 -20℃以下的儲存器。
（十）離心管：錐形底、15mL ，具螺紋蓋。
（十一）離心機：懸臂式、可以容納 15mL 錐底離心管、轉速可達 675
g 以上。
（十二）定量瓶：10、25、50 或 100 mL 褐色定量瓶。
（十三）移液管：0.5、1、2、3、4、5 或 10mL A 級玻璃移液管。
（十四）恆溫水浴槽：循環式。
（十五）分光光度儀：狹縫寬度（band width）小於 2.0 nm ，靈敏度
達0.001 。
（十六）螢光光度計：激光波長 436nm，放射光波長 680nm，光源為藍
光（Turner Designs Model 10 AU 激發濾鏡 436FS10 及放
射濾鏡 680FS10 或同等級產品）。
（十七）研磨機：具組織研磨效果者。
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五、試劑
（一）試劑水：水經蒸餾後通過陰離子與陽離子交換樹脂的水，其導電
度在 25 ℃為 0.056 μmho/cm 。
（二）丙酮：層析級。
（三）葉綠素 a 標準品：不含葉綠素 b（Sigma EC No 207-536-6 或
同等級產品）。
（四）90％丙酮水溶液：以量筒量取 100 mL 試劑水置於 1L 燒杯或儲
存瓶中，再以量筒量取 900 mL 丙酮，倒至上述燒杯或儲存瓶中
，混勻後標誌清楚。
（五）葉綠素 a 儲存液：買來的固體標準葉綠素 a，必須存放在低於
-20℃黑暗處。葉綠素 a標準儲存液配製時，輕輕敲打玻璃瓶，
使固體標準葉綠素 a 均集中在瓶底，然後在暗處將瓶蓋打開，
將瓶中所有的固體葉綠素 a 倒至 50mL 的量瓶中，以 90 ％丙
酮水溶液稀釋之，貼上標籤，包上錫箔紙，以避光。依下述八、
結果處理（二）之分光光度計方法定量之，並將剩餘的溶液裝入
密封的容器內，存放在低於 -20℃黑暗處，可保存 6 個月，每
次使用前均必須以分光光度計再行定量。
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六、採樣及保存
（一）視水中浮游藻類密度而定，採取代表性水樣約 100 至 4000mL，
並記錄採樣體積、採樣時間及地點等。
（二）採樣後將水樣混合均勻，量取適量水樣（視水樣而調整），立即
進行過濾濃縮。水樣濾至接近抽乾時，關閉真空抽氣部分（壓力
不得超過 0.2 kg/cm2 或 20 kPa），以避免過度抽乾；過濾時
間不得超過 10 分鐘。過濾之水樣量以使濾紙呈微帶綠色或褐色
者為佳。以鑷子移去濾紙，將含顆粒物質的那一面朝內一摺，並
用吸水紙將過多的水分吸乾，再將濾紙置放於適當的容器內。若
無法立即萃取，應將存放濾紙的容器以錫箔紙包裹避光，存放在
-20℃以下的冷凍櫃，但運送過程中可暫時（2 至 4 小時）存
放在冰桶（0-4 ℃）或液態氮桶中。
（三）過濾的濾紙若保存在低於 -20℃冷凍櫃中，保存期限不可超過一
個月。
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七、步驟
（一）檢量線之製作
每兩個月須做一次檢量線，但如果儀器有調整或更換燈管、濾鏡
或其他光學零件時須重新製作檢量線。製作檢量線時，先取葉綠
素 a標準儲存液至定量瓶中，以 90 ％丙酮水溶液稀釋之，配製
5 種不同濃度的標準稀釋液，使用前才配製。分析前先以90％丙
酮水溶液分別對分光光度計（波長 664.3與 750 nm） 與螢光儀
歸零，再將五種濃度的標準溶液分別測吸光值與螢光值，吸光值
經八、結果處理（二）之公式算得葉綠素 a含量，以此含量值作
檢量線，來校正螢光儀之測值。
（二）葉綠素 a 之萃取和測定
1.如果濾紙存放在冰箱中，取出至暗處回溫。將研磨器架設好，
工作台的燈光調至能供儀器操作之最低光度。將濾紙移入研磨
器內，移入前可將濾紙剪成小片狀，以玻棒將濾紙推到研磨器
底部，加入 4 mL 90％丙酮水溶液，研磨成泥狀（注意：研磨
過程不可過熱）。以 6 mL 90％丙酮水溶液潤洗研磨器及研磨
棒後，將潤洗液與泥狀物混合置於離心管內，旋緊螺紋蓋震盪
混合，在 4℃暗處，直至下一個步驟－離心。處理下一個濾紙
前研磨管棒及其管需用裝有丙酮和水溶液的洗滌瓶清洗，以去
除任何殘留在研磨器具上的物質，最後必須再以丙酮潤洗，才
進行下一個樣品。
2.將研磨好的樣品，充分混合後置於 4℃暗處浸泡至少 2 小時
，但不得超過 24 小時，在此過程中至少應從 4℃暗處取出震
盪混合一次。
3.浸泡完成後，取出震盪混合之，以水浴回溫至室溫 3 分鐘，
以675 g 離心 15 分鐘或是 1000 g 離心 10 分鐘，取其上澄
液，進行下一步驟，螢光光度值的分析。
4.以螢光儀測樣品之螢光值，依檢量線推算其葉綠素 a 含量。
當螢光值超過所製作的檢量線最高濃度之測值時，須加以稀釋
，直至落在檢量線範圍內。
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八、結果處理
（一）樣品葉綠素a濃度之測定：
樣品之螢光儀測值經由檢量線可求得葉綠素 a 之濃度（μg/L）
。依下式計算水樣中葉綠素 a 之濃度：
A × V
水樣中葉綠素 a 的含量（μg/L） 為＝────
10
A ：由檢量線求得之葉綠素 a 濃度（μg/L）。
V ：使用之原水樣體積（mL）。
（二）用分光光度計分析標準品稀釋液之葉綠素 a濃度時，先以90％丙
酮水溶液將分光光度計歸零，然後在波長 664.3與 750 nm 測定
其吸光值，分別得 Abs664.3 和 Abs750 ，再依下式計算葉綠素
a 濃度：
（Abs664.3-Abs750）× 106
標準品之葉綠素 a 濃度（μg/L）＝────────────
（87.67 × 樣品槽的光徑）
以計算所得之標準品葉綠素a濃度作檢量線。
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九、品質管制
（一）萃取和測定過程必須在弱光下進行﹐並使用不透明容器以避免葉
綠素 a 分解。
（二）所有的光合色素對光線及溫度都很敏感，所有試驗過程必須在低
光度下進行；所有的標準品、品質管制樣品及過濾後的樣品必須
保存在 -20℃以下黑暗環境中，以避免降解。
（三）檢量線製作：每批次樣品應重新製作檢量線，並螢光測值與分光
光度計推算的葉綠素濃度做相關係數（R 值）。R 值應大於或等
於 0.99。
（四）空白分析值
每一批樣品須以一片不含葉綠素 a 之玻璃纖維濾紙，依步驟七
、（一）與樣品同時做空白分析，同一批樣品萃取過程中，空白
分析須安排在最後一個作萃取，以了解試劑是否有被污染。
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十、精密度及準確度
表一為單一實驗室對不同樣品進行 2 小時與 24 小時萃取時間的精
密度。
表二為單一實驗室針對二種不同藻種過濾不同體積量的準確度。
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十一、參考資料
（一）行政院環境保護署環境檢驗所水中葉綠素 a 檢驗方法－丙酮
萃取法。NIEA E507.01T﹐1994.。
（二）US EPA Method 445.0. In vitro determination of chlorop
hyll a and pheophytin a in marine and freshwater algae
by fluorescence. 1997.
（三）Welschmeyer, Nicholas, A., Fluorometric analysis of ch
lorophyll a in the presence of chlorophyll b and pheop
igments. Limnol. Oceanogr. 39（8）, 1985-1992, 1994
註：操作安全注意事項
1.本方法所使用各種試劑之毒性或致癌性並不明確，但可能對人體健
康有害，故應儘量避免可能的曝露。檢驗室應有勞工主管機關對於
各化合物之安全操作規定，並將有關資料分送實驗人員。
2.在進行研磨萃取濾紙時，應在抽風櫃中操作，以減少操作人員吸入
太多量之丙酮。
3.實驗室人員應減少或消除廢棄物的量或毒性，本檢測方法產生之廢
液，依丙酮廢液處理原則處理。
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