一、方法概要
本方法係使用環境衛生用藥，經噴灑或塗抹等方式得以消滅菌株 (可
測試菌株如表一) 。經使用環境衛生用藥殺菌劑後，檢測其微生物殺
菌率可達 99.9 ％以上。
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二、適用範圍
本方法適用於環境衛生之環境殺菌劑。
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三、干擾
(一) 樣品中含有抑制或促進細菌、酵母菌或黴菌生長之物質。
(二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進細菌、酵母菌或黴菌生
長的物質。
(三) 其他。
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四、設備
(一) 量筒：一般使用 100、500 及 1,000 mL 之量筒。
(二) 定量瓶：一般使用 1,000及 2,000 mL 之量筒。
(三) 吸管：一般使用有 0.1 mL 刻度之1、 5 及 10mL 滅菌玻璃吸管或
市售無菌塑膠吸管，或無菌微量吸管 (Micropipet) 。
(四) 培養皿： 90×15 或 100×15 mm 之滅菌玻璃培養皿或市售無菌塑
膠培養皿，底面平滑無氣泡、刮傷或其他缺點者。
(五) 稀釋瓶：一般使用 100、250、500 及 1,000 mL 可滅菌之硼矽玻
璃製品。
(六) 三角錐瓶：一般使用 500 及 1,000 mL 可滅菌之硼矽玻璃製品。
(七) 容器：容量 120 mL 以上可滅菌之硼矽玻璃瓶或無菌塑膠製有蓋容
器，或市售無菌袋。
(八) 冰箱：溫度能保持在 0 至 5℃ 者。
(九) 水浴槽：溫度能保持約 50 ℃ 者。
(十) 培養箱：溫度能保持在 35 ± 1℃ 者 。
(十一) 高壓滅菌釜：用於培養基和稀釋液等不能乾熱滅菌之材料及用具
等之滅菌。溫度能保持在 121℃ (壓力約 15 lb/in2 或 1.2 k
g/cm2) 滅菌 15 分鐘以上者。
(十二) 無菌操作檯﹕垂直循環負壓式無菌操作檯有 UV 燈、高效率過濾
網、預濾網及有玻璃拉門。
(十三) 乾熱滅菌器 (烘箱) ：用於玻璃器皿等用具之滅菌。溫度能保持
在 160℃達 2 小時或 170℃達 1 小時以上者。
(十四) 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
(十五) 彎曲玻璃棒：直徑 3 至 4 mm ，其形狀與規格如圖一所示。
(十六) 天平：能精秤至 0.01 g 者。
(十七) 接種裝置﹕適用於細菌、酵母菌或黴菌之移植者。
(十八) 測試菌株﹕每mL菌數介於105 至107之間者。
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五、試劑
(一) 培養基：可選取下列之胰蛋白大豆瓊脂培養基 (Tryptone soy ag-
ar，TSA) 或培養皿計數培養基 (Plate count agar，PCA) 二者
之一來培養細菌。依下列配方配製培養基，或使用市售商品化的培
養基均可。使用沙氏葡萄糖培養基 (Sabouraud Dextrose Agar，
SDA) 或馬鈴薯葡萄糖培養基 (Potato dextrose agar，PDA) 來
培養黴菌及酵母菌。
1.胰蛋白大豆瓊脂培養基
胰化蛋白 (Tryptone) 15.0 g
大豆蛋白 (Soytone) 或蛋白 (Peptone) 5.0 g
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水 1 L
2.培養皿計數培養基
葡萄糖 (Glucose) 1.0 g
胰化蛋白 5.0 g
酵母抽出物 (Yeast extract) 2.5 g
瓊脂 (Agar) 15.0 g
蒸餾水 1 L
上述 1 及 2 之培養基經 121℃滅菌 15 分鐘後，冷卻至約為
50℃後，倒入適量之培養基於無菌培養皿中，於室溫下凝固。未
用完之培養基可保存於冰箱中，保存時間以不超過兩週為限。亦
可根據檢驗需求量，依配方比例配製培養基。
3.沙氏葡萄糖培養基
葡萄糖 (Dextrose) 40.0 g
胰化蛋白 10.0 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 L
4.馬鈴薯葡萄糖培養基
葡萄糖 1.0 g
胰化蛋白 5.0 g
酵母抽出物 2.5 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 L
上述 3 及 4 之培養基經 121℃滅菌 15 分鐘後，冷卻至約為
50℃後，培養基分別倒入約 15mL 至無菌培養皿中，於室溫下凝
固。未用完之培養基可保存於冰箱中，保存時間以不超過兩週為
限。可根據檢驗需求量，依配方比例配製培養基。
(二) 無菌稀釋液
1.磷酸二氫鉀溶液
取 3.4g 磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 溶於 50mL 之蒸餾水中，俟完全
溶解後，以 1.0N 氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為 7.2 ± 0.5 。
然後加蒸餾水至全量為 100mL，儲存於冰箱中做為原液備用。
2.氯化鎂溶液
取 8.1 g 氯化鎂 (MgCl2．6H2O) ，先溶於少量蒸餾水中，俟完
全溶解後，再加蒸餾水至全量為 100 mL， 儲存於冰箱中做為原
液備用。
分別取 10mL 氯化鎂溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀溶液再加入蒸餾
水至全量為 2,000 mL，混搖均勻後，分裝於稀釋瓶中，經 121
℃滅菌 15 分鐘，做為無菌稀釋液備用。
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六、步驟
下列之步驟 (一) 至 (五) 須在無菌操作台內操作。
(一) 形成單一菌落之方法﹕一般使用平面培養基，將欲分離之菌落予以
三區劃菌或其它適當之純化方法，選出欲測試之菌落，供為殺菌劑
藥效測試用。若欲分離酵母菌或黴菌應選用適當方法。
(二) 使用濁度計方法或其它適當方法，將已純化的菌落 (一般挑選用平
面三區劃菌法最後一區劃菌所得之菌落) 加入已滅菌之稀釋液容器
中，選用適當的濁度換算成濃度 (每 mL 菌數介於 105 至 107
CFU/mL之間者) 予以測試。
(三) 視樣品中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟，使用無菌吸管吸
取 9 mL 之藥劑至無菌試管中，並加入 1 mL 的測試菌液形成 10
倍稀釋度之水樣，混合均勻，而後自 10 倍稀釋度測試菌液以相同
操作方式進行一系列適當之 100、 1,000倍、10,000、、、等之稀
釋水樣並混搖均勻。進行稀釋步驟時，均需更換無菌吸管。
(四) 以 1 mL 無菌吸管或無菌微量吸管 (Micropipet) 吸取 0.2 mL 的
菌液及 (或) 各稀釋濃度水樣滴在培養基上，每一稀釋濃度做五重
複，將無菌之彎曲玻璃棒放在培養基上，再用手或旋轉桌 (Turn
table) 旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面。
(五) 對照組，以適當濃度之原始測試菌液為對照組。
(六) 倒置培養皿於培養箱內，在 35 ± 1℃下培養 48 ± 2小時。若欲
培養酵母菌或黴菌應選用適當方法及培養條件，培養方法詳閱參照
生物資源保存及研究中心之方法。
(七) 計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之，若菌落太多造成
計數困難，則以 "菌落太多無法計數" (Too numerous to count，
TNTC) 表示。
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七、結果處理
(一) 數據處理﹕
1.以含 30 至 300 個菌落之同一稀釋倍數的五個培養皿計算其總
菌落數，總菌落數以 菌落數 (CFU)/mL (Colony forming units
/ mL) 表示之。計算公式如下：
總菌落數 (CFU/mL) ＝選取培養皿之菌落數總和／選取之實際體
積總和=X+Y+Z+A+B / (0.2/D) +(0.2/D) +(0.2/D) +(0.2/D) +(
0.2/D)
X，Y，Z，A，B： 同一稀釋倍數兩個培養皿之菌落數。
D：稀釋倍數。
2.培養皿之菌落數不在 30 至 300 個菌落之間時，則依菌落數實
際數目以下列方式處理：
(1) 若各稀釋度中僅有一個稀釋度之一個培養皿的菌落數在 30 至
300 個之間，則以上述七、 (一) 、1 公式計算之。
(2) 若培養皿中均無菌落生長，則總落數以小於 5 CFU/mL (若無
生長為小於 1/0.2 mL 即為小於 5 CFU/mL) 表示；若僅有原
始水樣有菌落產生且少於30個，則以實際菌落數的平均值乘以
5 後的數值表示。
(3) 若各稀釋度培養皿之菌落數均不在 30 至 300 個之間，則以
最接近 300 個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿以上述七、
(一) 、1 公式計算。
(4) 若各稀釋度中有兩個稀釋度的培養皿之菌落數在 30 至 300
個之間，則以下列公式計算：
總菌落數 (CFU/ mL)= 選取培養皿之菌落數總和／選取之實際
體積總和= X1+ X2+ X3+ X4+ X5+ Y1+Y2+Y3+ Y4+ Y5 / (0.2/
D1) +(0.2/D1) +(0.2/D1) +(0.2/D1) +(0.2/D1)+ (0.2/D2)
+(0.2/D2) +(0.2/D2) +(0.2/D2) +(0.2/D2)
註：D1、D2：菌落數在 30 至 300 個之間的稀釋度 X1+ X2+
X3+ X4+ X5：D1稀釋度的五個培養皿之菌落數 Y1+Y2+Y3+
Y4+ Y5：D2 稀釋度的五個培養皿之菌落數
(二) 若計算所得之總菌落數小於 1 (含0)，以 "＜1"表示；總菌落數小
於 100 時，以整數表示 (小數位數四捨五入) ，總菌落數大於 1
00 以上時，只取兩位有效數字，例如總菌落數為 142 時以 1.4
x 102 表示，總菌落數 155 時以 1.6 x 102 表示，總菌落數為
18,900 時以 1.9 x 104 表示。
(三) 經使用環境衛生用藥後檢測其微生物殺菌率可達 99.9 ％以上以上
。
(四) 檢測紀錄須註明培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各
稀釋度的數據等相關資料。
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八、品質管制
(一) 微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
(二) 進行微生物檢測時所用的玻璃器皿及設備均須經滅菌處理。
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九、精密度及準確度
略。
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十、參考資料
(一) U.S. APHA-AWWA-WPCF.Standard Methods for the Examination
of Water and Wastewater,20th ed.pp.9-31.American Public
Health Assoc., Washington,D.C. . 1998
(二) 中國國家標準，食品微生物之檢驗法－總菌落數之檢驗。經濟部中
央標準局， CNS 10890 6186，1988。
(三) 徐爾烈。環境用藥有機磷殺蟲劑及殺菌劑使用安全評估。行政院環
境保護署。309 頁。2001。
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